沙棘總黃酮抗單側輸尿管梗阻大鼠腎臟纖維化作用及機制

李藝文，唐志書*，張珍*，梁濤，宋忠興，王昌利，，馬虎強，王宇鵬（.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育）/陜西中藥產業(yè)技術研究院，陜西 咸陽 708；.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽 7046；.內蒙古海天制藥有限公司，內蒙古 通遼 08000）

慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）是指由于各種原因引起的慢性腎臟結構和功能障礙，包括各種原發(fā)的、繼發(fā)的腎小球腎炎、腎小管損傷和腎血管的病變等，其特點是發(fā)病率高、伴發(fā)的心血管患病率高、病死率高[1]。腎臟纖維化是CKD的主要病理基礎。目前研究認為腎臟纖維化不可逆，臨床上用于治療的藥物主要分為血管緊張素轉換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑兩大類，但是治療效果不佳，且伴隨一系列的不良反應[2]。因此，尋找有效減緩腎臟纖維化的藥物已成為CKD治療的關鍵。

沙棘總黃酮（total flavonoids of hippophae，TFH）是從沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn.）中提取的有效活性成分，主要含有槲皮素、異鼠李素及山柰酚等[3]。近年多項研究發(fā)現，槲皮素可改善單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstructive，UUO）大鼠腎功能，具有抗UUO大鼠腎臟纖維化的作用[4-6]；異鼠李素具有抗肝臟纖維化和肺纖維化的作用[7-9]；因此，推測沙棘總黃酮可能具有抗腎臟纖維化的作用。本研究擬建立UUO大鼠腎臟纖維化模型，研究沙棘總黃酮對UUO大鼠腎臟纖維化的影響，并探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量（200±10）g [成都達碩實驗有限公司，動物生產許可證號SCXK（川）2020-030]。

1.2 試藥

沙棘總黃酮（陜西海天制藥有限公司，以異鼠李素為標準，沙棘總黃酮含量為30%）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、鈣黏附蛋白-E（E-cadherin）、細胞間隙連接蛋白（Cx43）（美國Cell Signaling Technology公司）；纖維連接蛋白（Fibronectin）（美國Santa Cruz biotechnology公司）；轉化生長因子-β1（TGF-β1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（中國Proteintech公司）；HRP標記山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗、RIPA（強）裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司）；內源性H2S檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PVDF膜（美國Merck Millipore公司）。

1.3 儀器

LD5-2A型低速離心機（北京雷博爾）；DSZ 2000X型倒置顯微鏡（重慶澳浦）；Thermo Multiskan GO多功能酶標儀（美國Thermo）；Western blot曝光儀器ChemiDoc XRS＋凝膠成像1708265（美國Bio-bad）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

雄性SD大鼠50只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（35 mg·kg－1）麻醉大鼠，腹部左側切口，雙結扎左側輸尿管的近端中上三分之一處，然后在兩個結扎處之間將輸尿管剪斷，逐層縫合腹腔。假手術組僅游離，不結扎不剪斷[10]。將50只大鼠隨機分為5組（n＝10）：假手術組、模型組、依那普利組（10 mg·kg－1）、沙棘總黃酮低劑量組（175 mg·kg－1）、沙棘總黃酮高劑量組（350 mg·kg－1）。給藥組使用蒸餾水配制并灌胃給藥，假手術組及模型組給予等量蒸餾水灌胃。術前給藥3 d，術后連續(xù)給藥2周，每日一次。

2.2 標本采集

手術2周后，用1%戊巴比妥鈉（35 mg·kg－1）麻醉，腹主動脈采血，收集血清，將其保存于－80℃。取左側腎臟組織，除去腎包膜，生理鹽水沖洗，從中間縱切，1/2固定于4%多聚甲醛，1/2保存于－80℃進行后續(xù)蛋白表達分析。

2.3 腎組織形態(tài)學觀察

2.3.1 測定腎臟重量、皮質厚度及長度 將腎臟取出后，生理鹽水沖洗，稱重。將固定后的1/2腎臟取出，觀察UUO誘導大鼠腎臟大小和腎盂擴張情況，腎臟縱切面測量腎皮質厚度和腎臟長度。

2.3.2 Masson染色 腎臟組織用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，石蠟包埋、切片，進行Masson染色。觀察腎小管擴張、管型形成和間質細胞外基質沉積，并采用Image J軟件對膠原纖維的藍色陽性染色進行定量分析。

2.3.3 免疫組化分析 石蠟切片脫蠟、水化后，置于枸櫞酸緩沖液中煮沸15 min；置3% H2O2中滅活，3%BSA 室溫封閉1 h；孵育Ⅰ抗：α-SMAⅠ抗的稀釋比例為1∶1000，Cx43 Ⅰ抗的稀釋比例為1∶100，FibronectinⅠ抗的稀釋比例為1∶500，置于4℃冰箱過夜；α-SMA、Cx43和Fibronectin Ⅱ抗的稀釋比例均為1∶200，室溫孵育Ⅱ抗1 h；按DAB顯色試劑盒說明配制顯色液，滴加后鏡下控制反應時間；洗滌、蘇木素復染、脫水、透明、封片。陽性表達呈棕黃色或深棕色染色，采用Image J軟件分析對陽性表達進行定量分析。

2.4 腎臟組織纖維化相關蛋白表達量檢測

取各組大鼠腎臟組織研碎，加入裂解液4℃低溫勻漿。將裂解物轉移至離心管中4℃ 12 000 r·min－1離心收集裂解液上清，采用BCA試劑盒蛋白定量，取60 μg蛋白樣品經10% SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，一抗4℃過夜，PBST洗膜，加入二抗，孵育1 h，洗膜后用ECL發(fā)光試劑顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。采用Image J分析軟件，以GAPDH為內參蛋白，定量計算各組樣品間蛋白相對表達量。上述實驗重復3次。

2.5 腎臟組織和血清中H2S檢測

采用內源性H2S檢測試劑盒檢測腎臟組織和血清中H2S水平，按照試劑盒說明操作，內源性H2S與醋酸鋅、N，N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應生成亞甲基藍，顯色，使用酶標儀在665 nm處測定吸光度，并進行統(tǒng)計分析。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，數據以均數±標準差表示，兩組數據比較采用t檢驗，組間數據比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 沙棘總黃酮改善UUO大鼠腎臟組織形態(tài)

造模第14日后，肉眼可見UUO導致大鼠腎臟腎盂擴張、皮質變薄，經測量發(fā)現UUO引起腎臟重量增加、皮質變薄、長度增大。給予沙棘總黃酮干預，以上各項腎臟形態(tài)指標均顯著改善（見圖1）。

圖1 沙棘總黃酮對UUO大鼠腎臟形態(tài)的影響（n＝4）Fig 1 Effect of TFH on the renal morphology in UUO rat（n＝4）

3.2 沙棘總黃酮減少UUO大鼠腎臟纖維化模型中膠原纖維的沉積

與假手術組相比，模型組大鼠腎臟的膠原纖維大量沉積，纖維化面積顯著增大（P＜0.01），表明造模成功。與模型組比較，沙棘總黃酮高、低劑量組大鼠的腎臟膠原纖維化面積顯著減?。≒＜0.05），表明沙棘總黃酮可有效減緩腎臟膠原纖維的形成（見圖2）。

圖2 沙棘總黃酮對UUO大鼠腎臟組織膠原纖維沉積的影響（n＝4，200×）Fig 2 Effect of TFH on the accumulation of collagen fibrils in UUO rat（n＝4，200×）

3.3 沙棘總黃酮抑制UUO大鼠腎臟組織Fibronectin的表達

免疫組化結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠腎臟組織中Fibronectin表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，沙棘總黃酮高、低劑量組Fibronectin表達顯著降低（見圖3A、B，P＜0.05）。Western blot結果表明，與假手術組相比，模型組Fibronectin蛋白表達顯著升高（見圖3C，P＜0.01）；與模型組比較，沙棘總黃酮高、低劑量Fibronectin蛋白表達水平明顯下調（見圖3C，P＜0.05）。表明沙棘總黃酮可降低細胞外基質（ECM）的沉積，有效改善UUO大鼠腎臟纖維化。

圖3 沙棘總黃酮對UUO大鼠腎臟組織ECM的影響（200×；A＆B.n＝4；C.n＝3）Fig 3 Effect of TFH on the expression of ECM in UUO rat（200×；A＆B.n＝4；C.n＝3）

3.4 沙棘總黃酮抑制UUO大鼠腎臟組織上皮細胞-間充質轉化（EMT）形成

免疫組化結果表明，與假手術組相比，模型組腎臟組織中α-SMA顯著升高（P＜0.01）；給予沙棘總黃酮高、低劑量組干預后，α-SMA顯著降低（P＜0.01）。Western blot結果發(fā)現，與假手術組相比，模型組α-SMA蛋白表達顯著升高，E-cadherin顯著降低（P＜0.05）；給予沙棘總黃酮高、低劑量干預后，α-SMA蛋白表達下調，E-cadherin蛋白表達上調（P＜0.05）。表明沙棘總黃酮能有效抑制UUO大鼠腎臟組織EMT的形成（見圖4）。

圖4 沙棘總黃酮對大鼠UUO腎臟組織EMT形成的影響（200×；A＆B.n＝4；C＆D.n＝3）Fig 4 Effects of TFH on EMT formation in UUO rat（200×；A＆B.n＝4；C＆D.n＝3）

3.5 沙棘總黃酮抑制UUO大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達

結果表明，與假手術組相比，模型組TGF-β1水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，沙棘總黃酮高、低劑量組TGF-β1水平均顯著下降（見圖5，P＜0.05）。

圖5 沙棘總黃酮對大鼠UUO模型誘導腎臟組織中TGF-β1水平的影響（n＝3）Fig 5 Effect of TFH on the TGF-β1 level in kidney tissue of UUO rat（n＝3）

3.6 沙棘總黃酮上調UUO大鼠腎臟組織和血清中H2S水平

與假手術組相比，模型組腎臟組織和血清中H2S水平顯著下降（P＜0.01），而沙棘總黃酮干預后，H2S水平均顯著升高（見圖6，P＜0.01），表明沙棘總黃酮可上調UUO大鼠內源性H2S水平。

圖6 沙棘總黃酮對大鼠UUO模型誘導腎臟組織和血清中H2S水平的影響（±s，n＝7）Fig 6 Effect of TFH on the kidney tissue and plasma H2S level in UUO rat（±s，n＝7）

3.7 沙棘總黃酮抑制UUO大鼠腎臟組織Cx43的表達

免疫組化結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠腎臟組織中Cx43表達顯著升高（P＜0.01），而沙棘總黃酮高劑量組的Cx43表達與模型組比較顯著降低（見圖7，P＜0.05）。

圖7 沙棘總黃酮對大鼠UUO模型腎臟組織中Cx43的影響（200×，n＝4）Fig 7 Effect of TFH on the expression of Cx43 in UUO rat（200×，n＝4）

4 討論

本研究建立經典的UUO大鼠腎臟纖維化模型，研究沙棘總黃酮對腎臟纖維化的影響及其機制。結果發(fā)現沙棘總黃酮改善UUO大鼠腎臟形態(tài)及皮質厚度，抑制UUO大鼠腎臟組織中膠原纖維形成和Fibronectin的表達，表明沙棘總黃酮能減少ECM的沉積；減少α-SMA的表達，增加E-cadherin的表達，表明沙棘總黃酮能抑制EMT的形成；其中沙棘總黃酮高劑量組效果強于沙棘總黃酮低劑量組。提示沙棘總黃酮具有抗腎臟纖維化的作用。

TGF-β1在纖維化的進展中起關鍵作用。TGF-β1主要介導TGF-β1/Smads和非Smad信號通路的激活，引起EMT的形成和ECM的進行性聚集，而ECM的降解減少，會導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化，最終使腎功能喪失[11]。本研究發(fā)現沙棘總黃酮可顯著抑制UUO大鼠腎臟組織TGF-β1的表達，但是沙棘總黃酮的抗腎臟纖維化作用是否通過TGF-β1/Smads和非Smad信號通路還需進一步的研究證實。

眾所周知，H2S是繼一氧化氮、一氧化碳后被發(fā)現的第三種人體內重要的氣體信號分子。臨床研究表明CKD患者血清中H2S水平下降[12]，多項研究表明UUO大鼠的H2S水平相比于假手術組顯著降低，給予NaHS供體干預，可顯著改善其腎臟纖維化[10]。本研究發(fā)現沙棘總黃酮可上調UUO大鼠腎臟組織和血清H2S水平，但沙棘總黃酮是否通過影響產生H2S相關酶CBS、CSE和3-MST的表達以及沙棘總黃酮如何通過上調內源性H2S改善UUO大鼠腎臟纖維化，有待進一步研究。

細胞間隙連接或稱縫隙連接，在腎臟組織中有著廣泛的分布，在維持腎臟組織結構和功能中起重要的作用[13]。Cx43蛋白是主要的間隙連接組成蛋白[14]。近年來有研究證實Cx43在高血壓性腎病和梗阻性腎病的早期表達增加，抑制Cx43表達降低了炎癥細胞浸潤和腎纖維化，并明顯改善了腎臟的結構和功能，Cx43被認為是治療CKD的新靶點[14，15-17]。本研究中發(fā)現沙棘總黃酮高劑量可顯著抑制Cx43的表達，表明其抗腎臟纖維化作用很可能是通過Cx43發(fā)揮的。

綜上所述，沙棘總黃酮可顯著改善UUO大鼠腎臟纖維化，抑制EMT形成和降低ECM沉積，其作用機制可能與降低TGF-β1表達，升高內源性H2S水平和抑制Cx43表達有關。沙棘總黃酮有可能發(fā)展為潛在的抗腎臟纖維化的治療藥物。