基于網絡藥理學和分子對接探討珠子參地上部分防治脂肪肝的作用機制

郭敏，賀依依，徐虹，姜祎*，張化為，楊新杰，黃文麗，鄧翀，許洪波，王薇*，宋小妹（.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 7046；.陜西省中藥資源產業化協同創新中心、陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 7046）

脂肪肝是由多種疾病和原因引起的肝臟脂肪性變[1]，可進一步發展為脂肪性肝炎、肝硬化、肝癌，而且脂肪肝是冠心病的易患因素之一[2]。由于其發病率不斷增加，已經成為一種嚴重威脅人類健康的高發疾病[3-4]。

珠子參為五加科植物珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng或羽葉三七Panax japonicusC.A.Mey.var.bipinnatifidus（Seem.）C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根莖[5]，主要分布在陜西、甘肅、寧夏、河南、湖南、湖北、四川、云南、西藏等地[6]。珠子參的化學成分多樣，主要包括三萜及其皂苷類、揮發油類、甾體及其皂苷類、黃酮類及微量元素等[7]，其中，珠子參的皂苷類化學成分表現出較強的抗腫瘤活性[8]和抗肝損傷作用[9]。珠子參的地上部分稱為“參葉”“漢中參葉”，局部地區僅將其作為茶葉飲用，利用率低。珠子參可通過抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）和C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達來抑制高脂飲食模型組大鼠的肝細胞凋亡，對高脂飲食誘發的肝損傷具有一定保護作用[10]。本研究擬對珠子參地上部分防治脂肪肝的有效成分以及相關作用機制進行探討。

本研究遵循網絡藥理學理論與技術[11]，篩選珠子參地上部分活性成分及潛在靶點，通過構建活性成分和靶標（C-T）、靶標和疾病（T-D）網絡圖，并進行GO功能和KEGG通路的富集分析以及分子對接驗證，通過實驗驗證珠子參地上部分對環氧合酶2（PTGS2）、絲裂原激活的蛋白激酶3（MAPK3）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）的影響，以期從分子層面初步探討珠子參地上部分防治脂肪肝的可能作用機制，為后續深入研究珠子參地上部分防治脂肪肝作用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 數據庫及軟件 TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；Swiss TargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）；Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）；Genecards數據庫（https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/）；Cytoscape 3.2.1軟件；功能蛋白聯系網絡（String）數據庫（https：//string-db.org/）；R project軟件；Autodock_vina 軟件（http：//vina.scripps.edu/）；Protein Data Bank數據庫（PDB https：//www.rcsb.org/）；運行環境 Microsoft Windows 10 Home Basic操作系統。

1.1.2 珠子參地上部分活性成分及其靶點的篩選

利用TCMSP數據庫、Swiss TargetPrediction數據庫及現有文獻報道，查找珠子參地上部分中的化學成分，在此基礎上以OB≥20%、DL≥0.1作為活性成分篩選條件[12]，將篩選出的活性成分逐一配對潛在作用靶點，再通過Uniprot數據庫進行靶點蛋白和基因信息校正，預測珠子參地上部分主要活性成分的靶點。

1.1.3 脂肪肝相關疾病靶點的篩選 以“fatty liver”為關鍵詞在Genecards數據庫中查找與脂肪肝相關的靶點。將活性成分靶點與疾病靶點取交集繪制韋恩圖，篩選出共同靶點。

1.1.4 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡的構建將珠子參地上部分活性成分與脂肪肝相關疾病靶點數據輸入Cytoscape軟件，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡。

1.1.5 關鍵靶點蛋白相互作用網絡的構建 將篩選出的共同靶點輸入String數據庫，構建靶點蛋白互作（PPI）網絡圖，在構建的PPI網絡圖中，節點的大小和顏色深淺反映了度值（degree）大小，邊粗細反應組合分數（combine score）大小。計算網絡中節點度值，度值越大代表節點在網絡中越處于核心地位，分析PPI網絡圖，并按度值大小進行分類。

1.1.6 關鍵靶點的GO分析與KEGG通路富集分析 使用R project軟件的生物學分析功能，對珠子參地上部分防治脂肪肝的關鍵靶點進行GO分析和KEGG通路富集分析。在此程序語言中，定義P＜0.05，Q＜0.05，最后將分析結果以條形圖的形式展示。

1.1.7 活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證根據上述篩選出的活性成分和核心靶點，從PDB 數據庫獲取相應靶點的蛋白結構，使用Autodock_vina 軟件對靶點與活性成分進行分子對接驗證。

1.2 動物實驗驗證

1.2.1 試藥與儀器 珠子參地上部分（來源于道地產區陜西秦嶺，經陜西中醫藥大學中藥資源辦公室鑒定為中藥珠子參的干燥帶莖葉）；生理鹽水（100 mL，西安京西雙鶴藥業有限公司）；魚肝油（批號：20200407，青島雙鯨藥業有限公司）；總膽固醇（T-CHO）測定試劑盒（批號：20200506）、三酰甘油（TG）測定試劑盒（批號：20200508）（南京建成生物工程研究所）。山羊血清（批號：SL038，北京索萊寶科技有限公司），DAB（批號：DAB-1031，福州邁新生物技術開發有限公司），HRP-山羊抗兔IgG（批號：115-035-003，美國Jackson ImmunoResearch公司）；PTGS2（WL0232a）、MAPK3（WL01864）、PPARG（WL01800）（萬類生物科技有限公司）。

GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司）；KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Elx808型吸收光酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ACS-A型電子計重秤（上海友聲衡器有限公司）；KDC-160HR型高速冷凍離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）。

1.2.2 實驗動物 昆明種小鼠40只，高脂飼料、普通飼料均由西安交通大學提供。高脂飼料：每500 g普通飼料加入蛋黃粉30 g，魚肝油2粒（含維生素A 4000單位，維生素D31400單位），白砂糖10 g、豬油10 g、食鹽3 g，混勻，制棒狀，90℃烘干[13]。

1.2.3 珠子參地上部分提取物的制備 取干燥珠子參地上部分320.00 g，加13倍量水，浸泡0.5 h，煎煮3次，每次2 h，過濾，合并濾液，濃縮，干燥，得到珠子參地上部分水提物粉末56 g。取珠子參地上部分水提物粉末適量，加水配制成0.2 g·mL－1的溶液備用。

1.2.4 肥胖模型建立 選用體質量20～24 g雌性小鼠24只，隨機分為正常組和肥胖模型組。正常組6只，喂養普通飼料；肥胖模型組18只，喂養高脂飼料。連續喂養35 d，期間質量小鼠均自由攝食、攝水。

1.2.5 實驗方法 將肥胖模型組小鼠隨機分為3組，分別為模型組、高劑量組和低劑量組，每組6只。模型組按0.2 mL/只灌胃生理鹽水，高劑量組按0.2 mL/只灌胃0.2 g·mL－1的珠子參地上部分提取物，低劑量組按0.1 mL/只灌胃0.2 g·mL－1的珠子參地上部分提取物，每日一次，連續灌胃一周。給藥結束最后1 d，禁食12 h，內眥取血，1000×g離心10 min分離血清，測定各組血清中 TG、TC水平。

取小鼠肝臟組織，將肝臟組織用4%多聚甲醛固定液充分固定后分為兩份進行組織學制片，一份樣品用30%蔗糖溶液脫水后用OCT包埋制作冰凍切片，冰凍切片制備完成后進行油紅O染色；另一份樣品用于免疫組化實驗，固定好的組織經包埋切片后，將切片脫蠟至水，抗原修復后使用3%過氧化氫室溫孵育25 mim，PBS清洗5 min（3次）；滴加10%正常山羊血清均勻覆蓋組織室溫封閉30 min；甩掉血清，加入按比例稀釋好的一抗均勻覆蓋組織，4℃過夜后從冰箱拿出切片復溫30 min，PBS洗5 min（3次），加入按比例稀釋好的二抗室溫孵育50 min，PBS洗5 min（3次）；用現配的DAB顯色，純水沖洗終止顯色；蘇木精復染，脫水、透明、封固。

2 結果

2.1 珠子參地上部分活性成分及其靶點篩選

經過篩選，共有5個主要活性成分與課題研究相關，如表1所示。對這5個成分進行靶點預測以及靶點蛋白和基因信息校正，篩選重復值后得到175個靶點。

表1 珠子參地上部分中的主要活性成分Tab 1 Main active ingredients in APRPM

2.2 脂肪肝相關疾病靶點的篩選

Genecards數據庫中共查找到與脂肪肝相關的靶點1481個，然后將上述的預測靶點與疾病靶點取交集繪制韋恩圖，篩選出共同靶點86個，如圖1所示，將其定義為珠子參地上部分防治脂肪肝的關鍵靶點。

圖1 脂肪肝相關靶點與珠子參地上部分作用靶點交集Fig 1 Intersection of related targets of fatty liver with in APRPM targets

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡的構建和分析

將珠子參地上部分活性成分與脂肪肝相關疾病靶點數據輸入Cytoscape軟件，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡，如圖2所示（其中藍色菱形代表藥物，粉色多邊形代表藥物中所含的活性成分，黃色六邊形代表疾病，藍色圓形代表藥物活性成分所作用的靶點映射到疾病的靶點；網絡圖中的節點代表珠子參地上部分及其有效活性成分、疾病、靶點等；邊代表珠子參地上部分與其活性成分、活性成分與成分作用靶點、疾病與作用靶點等之間的相互關系）。

圖2 珠子參地上部分防治脂肪肝的“藥物-成分-疾病-靶點”網絡Fig 2 “Drug-component-disease-target” network for the prevention and treatment of fatty liver in APRPM

2.4 關鍵靶點PPI網絡的構建

將篩選出的關鍵靶點輸入到String數據庫，構建珠子參地上部分防治脂肪肝靶點PPI網絡圖，如圖3所示。在構建的PPI網絡中共包含節點84個，邊513條。其中該網絡圖中靶點對應的平均度值為12.21，按照度值大于平均值篩選出的關鍵靶點有29個，如表2所示。靶點的度值越高，活性成分作用于該靶點發揮治療作用的概率越大。

圖3 珠子參地上部分防治脂肪肝靶點PPI網絡圖Fig 3 Protein-protein interaction network of APRPM prevention and treatment of fatty liver targets

表2 部分關鍵靶點的度值參數Tab 2 Degree parameters of some key targets

2.5 GO分析和KEGG通路富集分析

利用軟件R projiect分析86個關鍵靶點主要富集的細胞學組分、分子功能與生物學過程。其中所涉及的生物學功能與過程有類固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、不飽和脂肪酸代謝過程、脂肪酸衍生物代謝過程等。前20位GO分析結果見圖4。

圖4 關鍵靶點的GO富集分析Fig 4 Gene ontology pathway enrichment analyses

對珠子參地上部分防治脂肪肝的86個關鍵靶點進行 KEGG 富集分析，涉及的通路包括PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）、非酒精性脂肪肝通路（non-alcoholic fatty liver disease）、細胞色素P450對外源生物的代謝通路（metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、脂肪消化吸收通路（fat digestion and absorption）。通過通路富集分析發現這些信號通路對疾病的形成以及發展存在影響。前10位KEGG通路富集分析結果見圖5。

圖5 關鍵靶點的KEGG富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analyses

表3 珠子參地上部分防治脂肪肝相關信號通路Tab 3 Signal pathways related to the prevention and treatment of fatty liver by APRPM

2.6 分子對接驗證

使用分子對接模擬軟件Autodock_vina，將PPI網絡中度值排名靠前的靶點蛋白PTGS2、MAPK3、PPARG分別與珠子參地上部分活性成分進行分子對接驗證，計算活性成分與受體蛋白間的最低結合能。從PDB數據庫篩選的PTGS2受體蛋白PDBID為5F1A；MAPK3受體蛋白PDB-ID為4QTB；PPARG受體蛋白PDB-ID 為6MS7。若結合能＜0，表明配體分子均能和受體蛋白能自發地結合，且結合能＜－5.0 kcal·mol－1，表明其結合良好，結合能越小，結合性越好。分子對接最低結合能計算結果見表4，活性成分與受體蛋白對接的最低結合能對應的可視化結果見圖6。表4的結果表明大部分活性成分與受體蛋白的最低結合能均遠小于－5.0 kcal·mol－1，結合圖6的分子對接可視化結果，說明PTGS2、MAPK3、PPARG 3個靶點能夠與活性成分自發結合并借助氫鍵等分子間作用力形成較為穩定的構象。

圖6 活性成分與3種受體蛋白的分子可視化結果Fig 6 Visualization of molecular docking of active ingredients and 3 receptor proteins

表4 活性成分與受體蛋白的最低結合能Tab 4 Minimum binding energy of active ingredients and receptor proteins

2.7 實驗驗證

2.7.1 珠子參地上部分提取物對受試小鼠體質量的影響 給藥4～5 d后，受試小鼠體質量逐漸下降，給藥7 d后，與模型組相比較，高劑量組和低劑組小鼠體質量均明顯下降（P＜0.01）。7 d后高劑量組與低劑量組肥胖指數均低于正常組，見表5。

表5 給藥前后珠子參地上部分提取物對受試小鼠體質量的影響(±s)Tab 5 Effect of extracts from APRPM on the body mass of tested mice before and after the administration (±s)

表5 給藥前后珠子參地上部分提取物對受試小鼠體質量的影響(±s)Tab 5 Effect of extracts from APRPM on the body mass of tested mice before and after the administration (±s)

注：與模型組相比較，*P＜0.01（Compared with the model group，*P＜0.01）。

7 d后肥胖指數正常組 27.25±0.88 29.58±1.69 10.33±0.23 289.24±2.57模型組 31.92±2.18 34.58±2.69 11.03±0.23 295.13±4.19高劑量組 29.8±1.29 29.17±2.07* 10.85±0.11 282.69±5.49低劑量組 28.5±2.92 28.00±3.48* 10.88±0.17 280.21±7.78組別 初始體質量/g 7 d后體質量/g 7 d后體長/cm

2.7.2 珠子參地上部分提取物對受試小鼠血清TG、TC的影響 結果顯示，與對照組相比，高劑量組和低劑量組小鼠的TG和TC均有所降低，說明珠子參地上部分提取物能夠有效降低肥胖小鼠的TG和TC（見表6）。

表6 給藥后的TG、TC水平 (±s)Tab 6 Level of TG and TC after the administration (±s)

表6 給藥后的TG、TC水平 (±s)Tab 6 Level of TG and TC after the administration (±s)

注：與模型組相比較，*P＜0.01（Compared with the model group，*P＜0.01）。

組別 TG/（mmol·L－1） TC/（mmol·L－1）正常組 2.58±0.24 1.71±0.27模型組 2.74±0.31 1.67±0.35高劑量組 2.04±0.56* 1.51±0.39*低劑量組 2.13±0.40* 1.49±0.32*

2.7.3 珠子參地上部分提取物對肝臟組織的影響

正常組的肝細胞結構完整，脂肪滴極少，顏色淺；模型組脂肪滴數量明顯增多，顏色深，細胞界限較模糊；高劑量和低劑量組脂肪滴數量明顯少于模型組，高劑量組顏色與正常組接近，低劑量組顏色略高于正常組，結果見圖7。

圖7 油紅O染色觀察各組小鼠肝臟病理變化（200×）Fig 7 Hepatic pathological change of mice by oil red O staining in each group（200×）

2.7.4 珠子參地上部分提取物對肝臟組織中PTGS2、MAPK3、PPARG蛋白的影響 小鼠肝臟的免疫組化切片及光密度測定結果見圖8和圖9。結果顯示，與模型組比較，珠子參地上部分水提物顯著降低了小鼠的肝臟組織中PTGS2的表達，升高了MAPK3、PPARG蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01）。

圖8 各組小鼠肝臟組織中PTGS2、MAPK3、PPARG的蛋白表達（200×）Fig 8 Expression of PTGS2，MAPK3 and PPARG in the liver of mice in each group（200×）

圖9 珠子參地上部分對小鼠肝臟組織中PTGS2、MAPK3、PPARG蛋白表達的影響（n＝6）Fig 9 Effect of APRPM on protein expression of PTGS2，MAPK3 and PPARG in liver tissue of mice（n＝6）

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法結合分子對接，最終篩選出珠子參地上部分的活性成分5個，靶點175個；脂肪肝相關的疾病靶點1481個；構建的關鍵作用靶點的PPI網絡，其中包含節點84個，邊513條；分子對接結果顯示PTGS2、MAPK3、PPARG 3個核心靶點能夠與活性成分結合并借助氫鍵等分子間作用力形成較為穩定的構象。

在GO 功能和KEGG 通路富集分析結果中，珠子參地上部分防治脂肪肝的作用機制與類固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、不飽和脂肪酸代謝過程、脂肪酸衍生物代謝過程等生物學功能與過程有關以及和PPAR信號通路、非酒精性脂肪肝通路、細胞色素P450對外源生物的代謝通路、脂肪消化吸收通路等相關。

PTGS2、MAPK3、PPARG是PPI 網絡中按度值排名靠前的關鍵靶蛋白。PTGS2是前列腺素（PG）合成的關鍵酶，它在多種細胞和組織的炎癥過程及增殖中發揮重要作用[14]。PTGS2及其合成產物可以對脂肪、糖類、蛋白質的代謝產生作用，干擾肝臟正常的脂代謝，導致TC的蓄積[15]。脂質代謝紊亂會引發高脂血癥，最終導致脂肪肝、動脈粥樣硬化等疾病。免疫組化實驗說明珠子參地上部分能夠抑制PTGS2的表達，降低小鼠血清中TG和TC的含量，說明珠子參地上部分有一定調節脂質代謝的作用。MAPK3、MAPK8、MAPK1 均屬于MAPK（絲裂原蛋白活化激酶）家族。MAPK 可被上游激酶活化并磷酸化，從而活化下游因子，發揮調節細胞增殖、分化及死亡的作用[16]。PPAR是調節各種生化反應的配體激活型轉錄因子，有PPARA、PPARB、PPARG 3種亞型。研究證明，PPAR參與過氧化物酶體和脂質生長等過程，控制并調節參與糖及脂質代謝相關基因的表達、體內動態平衡以及脂肪形成等[17]。脂肪組織會分泌一些與脂肪移動有關的激素和細胞因子，而PPARG對脂肪細胞的增生和分化起著重要作用，PPARG被其配體激活后，能促進脂肪細胞分化，并能抑制這些細胞因子的表達和活性[18]。由于脂肪細胞主要存在于白色脂肪中，營養豐富時以TC的形式儲存能量，營養缺乏時以脂肪酸形式釋放能量，脂肪細胞的過度增生和分化可造成脂肪細胞生成過多，而PPARG的激活增加了脂肪酸的攝取，對脂肪細胞的分化起正向調節作用，抑制PPARG能阻斷脂肪細胞分化效應[19]。本研究中高劑量組和低劑量組TG和TC與模型組相比較均有所降低，說明珠子參地上部分水提物能夠影響脂肪細胞分化，明顯降低脂肪組織攝取脂肪酸。同時，利用Autodock_vina 對PTGS2、MAPK3、PPARG 3個靶點與活性成分進行分子對接驗證，結果顯示上述兩個靶點的受體蛋白均能與核心活性成分較穩定地自發結合。由此可以推測，珠子參地上部分可能通過活性成分作用于PTGS2、MAPK3、PPARG受體達到防治脂肪肝的效果。

免疫組化實驗結果顯示，與模型組比較，珠子參地上部分水提物顯著降低了小鼠的肝臟組織中PTGS2的表達，升高了MAPK3、PPARG蛋白的表達，說明珠子參地上部分能夠抑制肝臟組織中PTGS2受體蛋白的表達，增強MAPK3、PPARG受體蛋白的表達，證實其通過對PTGS2、MAPK3、PPARG 3個核心靶點的基因及蛋白的直接作用，發揮藥理作用，同時也印證了分子對接結果的合理性。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學、分子對接的研究方法，對珠子參地上部分防治脂肪肝的作用機制進行了系統分析和討論，并通過實驗驗證為研究其機制提供了部分依據，但圍繞珠子參地上部分防治脂肪肝的靶點、通路的驗證實驗仍需進一步展開。