香煙煙霧顆粒通過ERK1/2信號通路上調腎上腺素α1受體誘導血管平滑肌收縮

許夢榮，王川*，路鵬鵬，李慶智，梁濤，常卓琳，徐倉寶，張恩戶*（.陜西中醫藥大學藥學院/陜西省中醫藥管理局中藥藥效機制與物質基礎重點研究室，陜西 咸陽 7046；.西安醫學院基礎與轉化醫學研究所/陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室，西安 700）

吸煙嚴重危害人類健康。吸煙不僅是當今世界上最嚴重的公共衛生問題，也是人類健康面臨的可預防的最嚴重危險因素[1]。香煙燃燒時釋放出的物質多達4000種，有害物質主要有尼古丁、一氧化碳、氫氰酸、亞硝胺、內毒素、苯并芘等[2-3]。香煙煙霧在肺部激活炎性細胞，釋放炎癥介質進入血液循環影響心血管功能；也可以激活交感神經系統，引起兒茶酚胺釋放增加，心率加快，動脈痙攣，血壓升高；部分煙霧顆粒物也能直接穿過肺泡壁進入肺循環系統，與心血管系統直接作用[4-6]。吸煙是動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、中風等多種心血管疾病的重要危險因子[7-8]，甚至能引起吸煙者的血管功能明顯紊亂[9]，據統計，冠心病和高血壓病患者中大約75%有吸煙史[10]。腎上腺素α1受體在心血管疾病中起重要作用，與心血管疾病中的血管收縮有關[11]。交感神經興奮時釋放去甲腎上腺素，激動腎上腺素α1受體，收縮血管。有研究表明，高血壓患者血管對腎上腺素α1受體激動劑介導的收縮作用增強[12]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是細胞應激和損傷反應的主要信號通路，介導細胞生長、增殖、分化、死亡等多種生理和病理過程[13]。ERK1/2-MAPK信號通路的激活與動脈高反應性密切相關[14]，研究表明吸煙損傷動脈血管細胞，激活ERK1/2和NF-κB通路，使動脈血管平滑肌內皮素受體表達上調，導致動脈血管平滑肌呈現高反應性，ERK1/2信號通路也參與腎上腺素α1受體的調節作用，弱氧化型低密度脂蛋白激活 ERK1/2 信號轉導通路引起TNF-α和 IL-1β水平增高，上調小鼠腸系膜動脈腎上腺素α1受體，并且引起 腎上腺素α1受體介導血管收縮增強[15]。AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）是生物能量代謝調節的關鍵分子，AMPK的激活能夠調節能量代謝，具有心血管保護作用[16]。然而，香煙煙霧顆粒調節腎上腺素α1受體的作用機制還不十分清楚。研究香煙煙霧顆粒對腸系膜動脈腎上腺素α1受體的作用，對闡明吸煙致病機制有重要意義，本研究擬從大鼠腸系膜動脈平滑肌收縮功能考察香煙煙霧顆粒誘導腎上腺素α1受體在動脈高反應性中的作用及其相關信號通路。

1 材料

1.1 試藥

苯腎上腺素（PE）、乙酰膽堿（ACh）、二甲基亞砜（DMSO）、U0126、BAY 11-7082、AICAR、曲拉通X-100（Triton X-100）（Sigma公司）；腎上腺素α1受體抗體（Abcam）；β-actin、HRP Goat anti-Rabbi二抗（碧云天生物技術公司）。Na＋-PSS緩沖 液（mmol·L－1）：NaCl 119，NaHCO315，KCl 4.6，MgCl21.2，NaH2PO41.2，CaCl21.5和葡萄糖5.5（自制）；60 mmol·L－1K＋-PSS緩沖液為將Na＋-Krebs液中的NaCl換成相同摩爾濃度的KCl（自制）。DMEM高糖培養基（美國Hyclone，Cat No：SH30022.01）。

1.2 動物

SPF級雄性SD大鼠，10～12周齡，體質量（300±20）g [西安交通大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（陜）2015-003]。動物飼養于西安醫學院基礎轉化醫學院研究所動物飼養室，室溫20～22℃，相對濕度（40±5）%，自由飲食飲水。

1.3 儀器

SZ51體視顯微鏡（日本奧林巴斯）；離體組織浴槽系統（丹麥DMT620）；CO2培養箱（美國Thermo Scientific）；肌張力描記記錄系統（澳大利亞AD Instruments）；電泳儀、轉膜儀、凝膠成像系統（美國Bio-RAD）。

2 方法

2.1 香煙煙霧顆粒二甲基亞砜溶解物（DSP）的制備

實驗在負壓條件下進行，將點燃的3支香煙（市售，尼古丁含量0.8 mg，焦油含量11 mg）通過負壓使煙霧經過脫脂棉球，充分吸收煙霧后將脫脂棉球取出浸入1 mL DMSO中，使其充分溶解在DMSO中，過0.22 μm過濾器除菌，即得DSP[17]。

2.2 動脈組織培養

雄性SD大鼠斷頸處死后，無菌條件下迅速分離出大鼠腸系膜，浸泡于過濾除菌并預冷的Na＋-PSS緩沖液中，顯微鏡下分離出腸系膜動脈，0.1% Triton X-100血管內灌注10 s，去除血管內皮，剪成約1.5 mm的動脈環，放入24孔培養板內進行培養，每孔加入1 mL 不含血清的DMEM高糖培養基，通過不同實驗設計要求在培養基中加入DSP或溶劑對照DMSO及相應的信號通路阻斷劑（U0126、BAY 11-7082）或激活劑（AICAR）[16]。將培養板置于37℃含5% CO2氣體的培養箱內，根據實驗要求培養不同的時間，每隔24 h更換一次培養基。

2.3 離體肌張力描記

將5 mL 的Na＋-PSS放入恒溫離體浴槽DMT內，并將含95% O2和5% CO2的混合氣體不斷通入恒溫離體浴槽內，用兩根呈L型的鋼針將動脈環穿插連接起來，一根鋼針連接在張力傳感器上，另外一端則與微調裝置相連[17-19]。動脈環每隔20 min施加0.5 mN的預張力，直至2 mN，血管環平衡40 min后，加入K＋-PSS緩沖液（60 mmol·L－1K＋），檢驗動脈環收縮活性，若血管環在兩次K＋-PSS液中的收縮幅度均大于 5 mN并且兩次收縮差異低于10%時，該血管環用于下一步實驗，待第二次高濃度的K＋-PSS緩沖液引起的收縮穩定后加入ACh，若ACh引起的舒張率＜10%，認為動脈內皮已被去除[18-19]。采用濃度累加法加入PE（1×10－9～1×10－4mol·L－1），考察腎上腺素α1受體介導的收縮反應。

2.4 Western blot

取培養24 h的血管，提取組織總蛋白，BCA法檢測樣品蛋白含量。蛋白經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的Tris-鹽緩沖液（TBST）室溫封閉1 h，加入一抗（腎上腺素α1受體、p-ERK、ERK抗體及內參β-actin）4℃過夜，之后加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌，加入增加化學發光底物（ECL），使用化學發光成像系統檢測，檢測目標帶的分子量和光密度值，分析相關蛋白表達。

2.5 統計學分析

所有數據用均數±標準差表示。收縮性激動劑在動脈環上引起的收縮用60 mmol·L－1的K＋-PSS引起的收縮的百分數表示。使用IBM SPSS Statistics 25.0軟件采用單因素方差分析（ANOVA）進行多組數據間的比較[17]。

3 結果

3.1 DSP對腎上腺素α1受體介導的收縮反應的影響

使用0.1、0.2和0.4 μL·mL－1DSP（1 mL培養基中加入0.1、0.2、0.4 μL的DSP，即得）與動脈環共培養24 h，梯度累加法加入選擇性腎上腺素α1受體激動劑PE，得累積濃度-反應曲線見圖1。不同濃度的DSP均能誘導大鼠腸系膜動脈血管環收縮，且收縮反應呈濃度依賴性。與溶劑對照DMSO組相比，0.1 μL·mL－1DSP對去腎上腺素α1受體介導的氣管累積濃度-反應曲線沒有明顯的影響，而DSP 0.2 μL·mL－1和DSP 0.4 μL·mL－1組腎上腺素α1受體介導的累積濃度-反應曲線顯著左移（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot結果表明，DSP 0.2 μL·mL－1和DSP 0.4 μL·mL－1組均使腎上腺素α1受體的表達升高（P＜0.01）。因此后續實驗DSP濃度選擇為DSP 0.2 μL·mL－1。

圖1 DSP對PE介導的累積濃度-反應曲線的影響（A）及腎上腺素α1受體蛋白的表達（B）（±s，n＝6～8）Fig 1 Effect of DSP on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（A）and expression of α1-adrenoceptor protein（B）（±s，n＝6～8）

3.2 ERK1/2信號通路抑制劑U0126對腎上腺素α1受體介導的收縮反應的影響

為了考察ERK1/2信號通路是否參與了DSP引起的腸系膜動脈收縮，在培養時加入特異性ERK1/2信號通路抑制劑U0126（10 μmol·L－1）與0.2 μL·mL－1DSP共培養24 h。結果如圖2所示，與DSP組相比，ERK1/2信號通路抑制劑U0126可以顯著性抑制腎上腺素α1受體激動劑PE誘導的收縮反應（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot結果表明U0126可以降低腎上腺素α1受體的蛋白表達。DSP組p-ERK1/2蛋白的表達升高，表明DSP通過激活p-ERK1/2上調腎上腺素α1受體。DSP＋U0126組抑制了DSP誘導的腎上腺素α1受體上調。以上結果表明ERK1/2-MAPK信號通路可能參與了DSP上調腎上腺素α1受體引起的血管收縮。

圖2 ERK1/2抑制劑U0126對PE介導累積濃度-反應曲線（A）的影響及腎上腺素α1受體蛋白的表達（B）（±s，n＝7～9）Fig 2 Effect of ERK1/2 inhibitor U0126 on cumulative concentrationreaction curve induced by PE（A）and expression of α1 adrenoceptor protein（B）（±s，n＝7～9）

3.3 NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082對腎上腺素α1受體介導的收縮反應的影響

為了研究NF-κB是否和DSP誘導PE引起的收縮增強有關，加入0.2 μL·mL－1DSP和NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082（10 μmol·L－1）與動脈環共培養24 h。圖3結果顯示，與DSP組相比，NF-κB信號通路抑制劑BAY-117082不能消除DSP誘導PE增強血管收縮的作用。

圖3 NF-кB抑制劑BAY 11-7082對PE介導的累積濃度-反應曲線的影響（±s，n＝9）Fig 3 Effect of NF-кB pathway inhibitor BAY 11-7082 on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（±s，n＝9）

3.4 AMPK信號通路激活劑AICAR對腎上腺素α1受體介導的收縮反應的影響

為了研究AMPK信號通路是否參與了DSP引起的腸系膜動脈收縮，在培養時加入特異性AMPK信號通路激活劑AICAR（500 μmol·L－1）與0.2 μL·mL－1DSP共培養24 h。圖4結果表明，與DSP組相比，AICAR對DSP引起腎上腺素α1受體上調沒有明顯的影響，表明AMPK信號通路可能沒有參與DSP誘導腎上腺素α1受體介導的收縮反應。

圖4 AMPK激活劑AICAR對PE介導累積濃度-反應曲線的影響（±s，n＝8～10）Fig 4 Effect of AMPK pathway agonist AICAR on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（±s，n＝8～10）

4 討論

吸煙與動脈高反應性密切相關，然而吸煙導致動脈高反應性的分子機制還不清楚。香煙煙霧不僅導致高血壓、冠心病、中風、動脈粥樣硬化等一系列心血管疾病，還可引起血管的收縮及舒張功能失調造成相關的心血管疾病[14]。交感神經興奮，末梢釋放腎上腺素，激動血管平滑肌細胞膜上的腎上腺素受體，引起收縮血管，血管平滑肌的收縮功能是影響血管阻力的一個重要因素[20]。

本實驗用離體器官培養技術，從大鼠腸系膜動脈平滑肌收縮功能研究DSP誘導腎上腺素α1受體在血管高反應性中的變化及其相關信號通路。筆者發現DSP可引起大鼠腸系膜動脈平滑肌的腎上腺素α1受體介導的血管環收縮反應增強，腎上腺素α1受體表達增加，且呈濃度依賴性，該現象可能與DSP誘導的腎上腺素α1受體上調有關。

U0126是ERK1/2通路特異性抑制劑，抑制MEK，阻斷MEK1/2激酶激活，抑制下游ERK1/2 激酶激活。DSP增強血管收縮的作用及上調腎上腺素α1受體的表達可以被ERK1/2抑制劑U0126抑制，表明DSP上調腎上腺素α1受體的作用可能與ERK1/2信號通路有關。

NF-κB是MAPK下游的重要轉錄因子之一，BAY 11-7082是一種IκBα磷酸化和NF-κB抑制劑，選擇性且不可逆地抑制IκB-α磷酸化，并減少NF-κB和黏附分子的表達，本研究發現BAY 11-7082不能消除DSP誘導PE增強血管收縮的作用，AMPK的激活具有保護心血管的作用，AICAR是AMPK的激活劑，能在細胞內轉換為AMP類似物環腺苷-磷酸衍生物（ZMP），從而激活AMPK。本實驗使用AICAR和DSP共培養，結果表明AICAR不能逆轉DSP引起的收縮，提示DSP上調腎上腺素α1受體引起的收縮增強可能與NF-κB和AMPK通路無關。

DSP可以誘導動脈血管平滑肌細胞腎上腺素α1受體上調，導致動脈血管平滑肌對腎上腺素α1受體PE刺激呈高反應性、動脈血管收縮增強。ERK1/2信號通路將信息從細胞表面傳遞到細胞內，再轉導到細胞核，激活轉錄因子，介導生物學效應[21-23]。DSP激活ERK1/2信號轉導通路，可能激活其介導的轉錄和翻譯機制，合成新的腎上腺素α1受體，使動脈血管平滑肌腎上腺素α1受體表達上調，導致動脈血管平滑肌呈現高反應性。因此，阻斷ERK1/2信號轉導通路，可以抑制腎上腺素α1受體介導的收縮反應，改善動脈血管高敏感性和平滑肌高反應性，達到治療血管痙攣性疾病的目的。

本課題通過研究DSP對腎上腺素α1受體介導的血管高反應性的影響及機制，為血管高反應性疾病提供新的治療靶點。本研究結果提示開發控制細胞內ERK1/2信號通路的相關藥物是治療血管高反應性疾病的新思路。