基于UPLC-Q-TOF-MS法的郁金水提物的化學(xué)成分研究

張尚霞，王宇紅*，龍紅萍，劉檢，趙洪慶，凌佳，牟晴蕊（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，長沙 410208；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 410007）

郁金（Curcumae Radix）是姜科植物中廣西莪術(shù)、蓬莪術(shù)、溫郁金、姜黃的干燥塊根，郁金性苦寒，是活血化瘀的藥物，主要作用為理氣解郁、保肝利膽、祛瘀止血等，用于治療胸痹心痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、胸脅刺痛等臨床癥狀[1]。現(xiàn)代藥理研究表明郁金具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗氧化、抗血栓等作用[2-3]，因此有必要對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行全面研究。目前對(duì)郁金化學(xué)成分的研究多采用傳統(tǒng)的提取分離鑒定，存在周期長、效率低的問題，亟需建立一個(gè)多成分快速分析、能提供盡可能豐富可靠數(shù)據(jù)的方法。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)擁有色譜的高分離性能和質(zhì)譜高靈敏度的特點(diǎn)[4-5]，為中藥的質(zhì)量控制和資源合理利用奠定了基礎(chǔ)，已被廣泛用于天然藥物的分析，極大地推動(dòng)了中藥研究的發(fā)展。本文使用UPLC-Q-TOF-MS法，并結(jié)合中藥成分信息數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，探討郁金的化學(xué)成分，為郁金的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MassHunter質(zhì)譜工作站、Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF超高效液相-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜、Qualitative Analysis B.08.00數(shù)據(jù)處理軟件（美國Agilent公司）；Metler Toledo PL402-L電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）；SK-7200HP超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Eppendorf Centrifuge5424 R離心機(jī)（德國艾本德公司）。

1.2 試藥

質(zhì)譜級(jí)甲酸、質(zhì)譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)甲醇（Merck公司）；蒸餾水（深圳屈臣氏蒸餾水有限公司）。溫郁金（湖南衡岳中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：廣東，批號(hào)：190301，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部張志國教授鑒定為姜科植物溫郁金的干燥塊莖）。莪術(shù)醇對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100185-201908，純度：99.1%）。

2 方法

2.1 供試品溶液的配制

稱取郁金藥材50 g，加入1000 mL圓底燒瓶中，并加入10倍量超純水后，加熱煮沸，冷凝管回流煮沸1.5 h，冷卻，三層紗布過濾，繼續(xù)加8倍量超純水，加熱煮沸，冷凝回流煮沸1 h，冷卻，三層紗布過濾，合并兩次水提藥液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后真空干燥箱干燥。精密稱取干燥后的浸膏0.2000 g，加入甲醇5 mL，超聲30 min充分溶解，3000 r·min－1離心5 min，取上清液置于1.5 mL離心管中，12 000 r·min－1離心5 min，取上清液混勻后微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取對(duì)照品2.0 mg，置于10 mL量瓶，加70%的甲醇超聲溶解，定容成200 μg·mL－1的工作液母液，質(zhì)譜檢測時(shí)70%甲醇稀釋10倍，微孔濾膜過濾，即得對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；正離子模式時(shí)，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），負(fù)離子模式時(shí)，流動(dòng)相為乙腈（A）-5 mmol·L－1乙酸銨水（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～15%A；10～20 min，15%～30%A；20～30 min，30%～70%A；30～40 min，70%～95%A），流速為0.4 mL·min－1，進(jìn)樣量為2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

應(yīng)用電噴霧正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，掃描方式為MRE掃描，使用ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-8500）對(duì)準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行矯正。一級(jí)全掃質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1500，分辨率為30 000，除溶劑氣體為氮?dú)猓桓稍餁饬魉贋?.8 L·min－1；干燥氣溫度為325℃；毛細(xì)管電壓為4.0 kV；Fragment電壓為110 V；鞘氣溫度為350℃；二級(jí)質(zhì)譜使用依賴性掃描，在一級(jí)掃描基礎(chǔ)之上選擇前三強(qiáng)進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離（CID）獲取其二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站的特點(diǎn)，設(shè)置有效的閾值參數(shù)，對(duì)郁金水提物正負(fù)離子模式下采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢索化學(xué)成分的準(zhǔn)離子分子峰的信息，依據(jù)供試品質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子、色譜保留時(shí)間，結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）[6]和中藥綜合數(shù)據(jù)庫（http：//www.megabionet.org/tcmid/）[7]，參照化合物的對(duì)照品圖譜及電子期刊數(shù)據(jù)庫PubMed、CNKI，對(duì)郁金的化學(xué)成分的名稱、CAS號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量等信息進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 郁金水提物質(zhì)譜色譜峰的分析

郁金水提物正、負(fù)離子流圖如圖1所示。對(duì)郁金水提物正、負(fù)離子流圖進(jìn)行分析，結(jié)果共從郁金水提物中鑒定出52種已知化學(xué)成分，1種成分未知，化學(xué)成分的質(zhì)譜色譜信息如表1所示。

圖1 郁金水提物UPLC-Q-TOF-MS總離子流色譜圖Fig 1 TIC of water extract of Curcumae Radix by UPLC-Q-TOF-MS

表1 郁金水提物化學(xué)成分質(zhì)譜信息Tab 1 Chemical constituents in water extract of Curcumae Radix by UPLC-Q-TOF-MS

續(xù)表1

3.2 郁金化學(xué)成分裂解規(guī)律分析

采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析郁金二級(jí)質(zhì)譜，以化學(xué)成分4、11、27、39、51為例，分析郁金化學(xué)成分裂解規(guī)律，結(jié)果如下：

化學(xué)成分4（tR＝3.226 min）在正離子模式下m/z149.0591 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子峰m/z103，與化學(xué)成分總離子峰相差46，推測可能是化學(xué)成分失去了1個(gè)CO2分子后的離子碎片，分析該化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解過程與其他文獻(xiàn)相一致[15]，并參考該化學(xué)成分的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜總離子峰、裂解碎片等信息，因此，該化學(xué)成分被鑒定為肉桂酸，其裂解過程如圖2A。

化學(xué)成分11（tR＝14.51 min）在正離子模式下m/z253.1805 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子峰m/z235，與化學(xué)成分總離子峰相差18，推測可能是化學(xué)成分失去了1個(gè)H2O分子后的離子碎片，并參考該化學(xué)成分的色譜保留時(shí)間、總離子峰、裂解碎片等信息，鑒定其為郁金二醇。

化學(xué)成分27（tR＝23.518 min）在正離子模式下m/z265.1457 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子峰m/z247，與化學(xué)成分總離子峰相差18，推測可能是化學(xué)成分失去了1個(gè)H2O分子后的離子碎片，在負(fù)離子模式下m/z263.1274 [M-H]－，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子峰m/z245，與化學(xué)成分總離子峰相差18，推測可能是化學(xué)成分失去了1個(gè)H2O分子后的離子碎片，并參考該化學(xué)成分的色譜保留時(shí)間、總離子峰、裂解碎片等信息，該化學(xué)成分鑒定為反，反-1，7-二苯基-1，3-庚二烯-3-酮。

化學(xué)成分39（tR＝27.266 min）在正離子模式下m/z237.1844 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子峰m/z219，201，與文獻(xiàn)報(bào)道的莪術(shù)醇質(zhì)譜裂解過程相一致[16]。通過推測，碎片離子峰m/z219與化學(xué)成分總離子峰相差18，推斷可能是化學(xué)成分失去了1個(gè)H2O分子后的離子碎片，碎片離子峰m/z201與碎片離子峰m/z219相差18，推斷是碎片離子失去了1個(gè)H2O分子后的離子碎片，參考該化學(xué)成分的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜總離子峰、裂解碎片等信息，并與該化學(xué)成分的對(duì)照品相比較，該化學(xué)成分被鑒定為莪術(shù)醇，其裂解過程如圖2B。

圖2 郁金化學(xué)成分肉桂酸（A）、莪術(shù)醇（B）可能的裂解途徑Fig 2 Proposed fragmentation pathway of cinnamic acid（A），and curcumol（B）

化學(xué)成分51（tR＝33.844 min）在正離子模式下m/z217.1587 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子峰m/z201，與化學(xué)成分總離子峰相差15，推斷可能是化學(xué)成分失去了1個(gè)甲基化學(xué)基團(tuán)后的離子碎片，分析該化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解過程與其他文獻(xiàn)相一致[17]，參考該化學(xué)成分的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜總離子峰、裂解碎片等信息，該化學(xué)成分被鑒定為芳姜黃酮。

3.3 郁金水提物化學(xué)成分

將UPLC-Q-TOF-MS法分析獲得的52種郁金水提物化學(xué)成分進(jìn)行分類，可分為34種倍半萜類、4種二萜類、2種三萜類、4種姜黃素類、2種有機(jī)酸類和6種其他類化合物。

3.3.1 倍半萜類化合物 倍半萜類化合物是指分子中含15個(gè)碳原子并含有3個(gè)異戊二烯單元的天然萜類化合物，具有鏈狀、環(huán)狀等多種骨架結(jié)構(gòu)。本研究從郁金水提物中鑒定出34種倍半萜類化合物，分別為：zedoarolide B（5）、zedoalactone A（6）、zedoalactone B（8）、curcumenolactone C（9）、郁金二醇（11）、zedoalactone C（12）、異莪術(shù)烯醇（14）、歐亞活血丹內(nèi)酯（15）、異郁金二醇（16）、呋喃大牻牛兒酮（17）、香豆酚（18）、表莪術(shù)酮（19）、zedoarol（21）、aerugidiol（22）、polydactin B（24）、異原莪術(shù)烯醇（25）、郁金烯酮（28）、呋喃二烯（29）、莪術(shù)烯（31）、（1S，4S，5S，10R）-zedoarondiol（32）、二氫莪術(shù)二酮（33）、呋喃二烯酮（34）、石竹烯氧化物（35）、curdionolide B（37）、gajutsulactone A（38）、莪術(shù)醇（39）、4-epi-curcumenol（40）、costunolide（41）、zederone（42）、curcumenol（43）、codonolactone（44）、β-cuparenone（45）、8-hydroxycadalene（48）和桂莪術(shù)內(nèi)酯（50）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 郁金水提物的倍半萜類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 3 Chemical structure of sesquiterpenoids in water extract of Curcumae Radix

3.3.2 二萜類化合物 二萜類化合物是由4個(gè)異戊二烯單位構(gòu)成，含20個(gè)碳原子的化合物類群，結(jié)構(gòu)顯示多樣性。本研究從郁金水提物中鑒定出4種二萜類化合物，分別為：curcuminol C（7）、curcuminol D（46）、curcuminol A（49）和curcuminol B（52）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 郁金水提物的二萜類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 4 Chemical structure of diterpenoids in water extract of Curcumae Radix

3.3.3 三萜類化合物 三萜類化合物是由數(shù)個(gè)異戊二烯去掉羥基后首尾相連構(gòu)成的物質(zhì)，大部分含30個(gè)碳原子，少部分含27個(gè)碳原子的萜類化合物，在自然界分布廣泛。本研究從郁金水提物中鑒定出2種三萜類化合物，分別為促黃素Ⅱ（26）和二呋喃莪術(shù)烯酮（47）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖5 郁金水提物的三萜類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 5 Chemical structure of triterpenoids in water extract of Curcumae Radix

3.3.4 姜黃素類化合物 姜黃素類化合物按化學(xué)結(jié)構(gòu)特征分為單氧代型、雙氧代型、三氧代型、吡喃取代型、呋喃取代型、大環(huán)醚型、二聚體型等7個(gè)類型，對(duì)人體無毒，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究從郁金水提物中鑒定出4種姜黃素類化合物，分別為二氫姜黃素（23）、姜黃醇酮（30）、甜沒藥姜黃醇（36）和芳姜黃酮（51）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖6所示。

圖6 郁金水提物的姜黃素類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 6 Chemical structure of curcumin in water extract of Curcumae Radix

3.3.5 有機(jī)酸類化合物 有機(jī)酸類化合物是指一些具有酸性的有機(jī)化合物，最常見的有機(jī)酸是羧酸，這些化合物中的一部分能夠參與動(dòng)植物代謝進(jìn)程。本研究從郁金水提物中共鑒定出2種有機(jī)酸類化合物，分別為焦谷氨酸（1）和肉桂酸（4）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖7所示。

圖7 郁金水提物的有機(jī)酸類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 7 Chemical structure of organic acids in water extract of Curcumae Radix

3.3.6 其他類化合物 本研究從郁金水提物中鑒定出6種其他類化合物，分別為heterodendrin（2）、酪胺（3）、（E）-1，7-diphenyl-3-hydroxy-1-hepten-5-one（10）、反-1，7-二苯基-1-庚烯-5-醇（13）、反，反-1，7-二苯基-1，3-庚二烯-3-酮（27）和枯茗醛（53）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖8所示。

4 討論

目前，文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)郁金成分的研究多采用醇提法[18]，或采用超臨界流體萃取分離后，用氣相色譜-質(zhì)譜法分析[19]，或采用固相微萃取后，經(jīng)過氣相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行分析[20]，或用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油后，用GC-MS分析[21]，一般傾向于檢測揮發(fā)類成分，無法系統(tǒng)闡釋郁金的中等極性及大極性成分，缺乏對(duì)郁金成分的系統(tǒng)而全面的研究。本研究采用水提法提取郁金中的化學(xué)成分，可以進(jìn)一步探討郁金的中等極性及大極性成分，同時(shí)研究表明郁金水提物的化學(xué)成分可能具有抗抑郁、抗血栓、改善學(xué)習(xí)記憶能力等作用[22-24]。錢海兵等[22]研究表明郁金水提物對(duì)抑郁癥大鼠的獎(jiǎng)賞行為、自發(fā)性探索行為均有一定的療效，且對(duì)抑郁癥大鼠海馬區(qū)的血管新生有一定的作用；宿玉等[23]研究表明桂郁金水提物可以調(diào)節(jié)前列環(huán)素（PGI2）和血栓素A2（TXA2）之間的相對(duì)穩(wěn)定，主要通過增加內(nèi)皮細(xì)胞中PGI2的分泌，降低TXA2的合成，抑制血小板聚集并起到抗血栓的作用；李紀(jì)彤等[24]研究表明溫郁金水提物可以改善Aβ25-35引起的小鼠阿爾茨海默病的學(xué)習(xí)記憶能力。因此，本文對(duì)郁金水提物的成分進(jìn)行分析，旨在全面系統(tǒng)地分析郁金的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究選擇UPLC-Q-TOF-MS法探討郁金水提物中的化學(xué)成分，從郁金水提物中鑒定出52種化學(xué)成分，包括34種倍半萜類、4種二萜類、2種三萜類、4種姜黃素類、2種有機(jī)酸類和6種其他類化合物，為郁金臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。