復幼方藥味配伍對鹽知母中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷提取率及穩定性的影響

龐琳諾，倪健，蔡夢如，馬葆睿，張志勤，白杰，張萌，王曉玲*，曲昌海*（.北京中醫藥大學中藥學院，北京 0488；.首都醫科大學附屬北京兒童醫院，北京 00045）

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經，有清熱瀉火、滋陰潤燥之功[1-2]。新芒果苷、芒果苷、異芒果苷為知母藥材中具有代表性的雙苯吡酮類成分[3]，結構如圖1所示?，F代藥理研究表明，此類成分具有抗炎、降血壓、抗糖尿病等多種藥理作用[4-6]，知母飲片鹽炙后芒果苷含量顯著升高[7]、新芒果苷和異芒果苷含量降低[8]，且鹽炙后能夠促進新芒果苷在大鼠體內的吸收[9]。

圖1 芒果苷、異芒果苷及新芒果苷化學結構式Fig 1 Chemical structures of mangiferin，isomangiferin，and neomangiferin

復幼方為首都醫科大學附屬北京兒童醫院的臨床經驗方，鹽知母為方中君藥，全方由鹽知母、生地黃、玄參、醋鱉甲、關黃柏等11味中藥組合而成，鹽知母具有滋補肝腎、清熱瀉火的作用，用于治療女童性早熟療效確切[10]。原劑型為合劑，攜帶、貯存不便且口感不佳，本課題組擬將復幼方開發成質量穩定、療效確切的顆粒劑，以君藥鹽知母中的芒果苷作為質量控制的指標性成分之一，在復方工藝研究過程中發現，芒果苷在提取和干燥過程中，含量損失較大，80℃下減壓干燥，芒果苷損失率約48%。而在同樣條件下對鹽知母進行單獨提取，芒果苷的含量卻并未發生明顯變化。

作者在前期研究中還發現，在相同提取條件下，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷在單體溶液及鹽知母水提液中穩定性良好，在復幼方水提液中3種成分含量發生改變，由此猜測復幼方中的其他藥味會對這3種成分產生影響。目前關于此3種成分穩定性的相關報道較少，僅有研究表明，新芒果苷、芒果苷受熱后化學結構發生變化，轉化為其他成分[11]。本研究建立高效液相色譜分析方法，以3種成分作為指標，全面系統考察復幼方全方提取、不同配伍組合提取、鹽知母單獨提取過程中3種成分的變化情況，并對不同藥味配伍提取后水提液中3種成分的穩定性進行研究，嘗試闡明影響復幼方中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷提取率和穩定性的關鍵因素，并對復幼方提取中芒果苷不穩定的原因進行探討，以期為其他含知母藥材中藥復方的研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZTW型電子調溫電熱套（北京中儀泓瑞科技發展有限公司）；JY5002型電子天平（精度：0.01 g，上海衡平儀器儀表廠）；MS105DU型電子分析天平（精度：0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司）；FiveEasy Plus型pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB-5200DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-20A DAD檢測器，LC Solution色譜工作站，日本島津）。

1.2 試藥

鹽知母、生地黃、玄參、鱉甲、關黃柏、地骨皮、牡丹皮等藥材均購于北京本草方源藥物有限公司，經北京本草方源藥物有限公司研究助理王穎鑒定。新芒果苷對照品（批號：C13S8G43633）、芒果苷對照品（批號：P04M9F60454）、異芒果苷對照品（批號：P10D10S105531）（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；娃哈哈純凈水，乙腈、甲醇為色譜純（Fisher公司），實驗用水為高純水，冰乙酸分析純（北京化工廠）。

2 方法與結果

2.1 3種成分含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 Agilent zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%醋酸溶液（9∶91，V/V），檢測波長：258 nm，流速：1.0 mL·min－1，柱溫：30℃，進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取異芒果苷對照品1.39 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得異芒果苷母液。精密吸取1 mL異芒果苷母液并分別精密稱取新芒果苷2.53 mg、芒果苷1.25 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取復幼方浸膏粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定重量，超聲30 min，放冷，甲醇補足失重，搖勻，濾過即得。

2.1.4 專屬性考察 制備不含鹽知母的陰性樣品溶液，取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液按“2.1.1”項下條件進樣檢測，結果見圖2，表明陰性樣品無干擾，方法專屬性良好。

圖2 混合對照品（A）、供試品（B）及陰性樣品（C）的HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substances（A），sample（B）and negative sample（C）

2.1.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下1、2、3、4、5、6、7 mL混合對照品溶液，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列質量濃度對照品溶液。按“2.1.1”項下條件進樣檢測，以質量濃度（mg·mL－1）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。新芒果苷、芒果苷和異芒果苷的回歸方程分別為Y＝1.32×105X＋1.14×105（r＝0.9998）、Y＝1.05×105X＋8.44×104（r＝0.9998）、Y＝9.31×103X＋7.96×103（r＝0.9991），表明新芒果苷進樣量在49.59～347.12 μg、芒果苷進樣量在24.50～171.68 μg、異芒果苷進樣量在2.72～19.07 μg與峰面積線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗 取同一份對照品溶液，按“2.1.1”項下條件連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD值。新芒果苷、芒果苷、異芒果苷峰面積RSD值分別為0.026%、0.057%、0.059%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下條件進樣測定，結果供試品中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷含量分別為0.95、0.38、0.058 mg·g－1，RSD值分別為0.78%、0.74%、2.8%，表明本方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收試驗 精密稱取浸膏粉約0.25 g于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，共9份，分為3組。每組分別加入適量對照品母液使加入量與供試品中成分含量之比約為1.2∶1、1∶1和0.8∶1，進樣測定各樣品中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的含量，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 新芒果苷、芒果苷及異芒果苷的加樣回收率(n＝3)Tab 1 Recovery of neomangiferin，mangiferin，and isomangiferin (n＝3)

2.2 藥味配伍對3種成分提取率的影響

為考察方中各藥味在提取過程中對鹽知母中3種成分提取率的影響情況，將方中10味藥材分別與鹽知母配伍，按處方比例及優選工藝進行分別提取，并在相同條件下單獨提取鹽知母和復幼方，將上述水提液放冷后定容至等體積，平行操作兩份。測定不同配伍水提液中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的峰面積，計算提取率，考察配伍對3種成分提取率的影響（本次實驗用鹽知母中新芒果苷的平均含量為11.06 mg·g－1，芒果苷的平均含量為10.25 mg·g－1，異芒果苷的平均含量為0.94 mg·g－1），結果見表2。

表2 不同藥味與鹽知母配伍提取后3種成分的提取率(%，n＝2)Tab 2 Extraction rate of 3 components of different compatibility medicinal with salt processed Rhizoma Anemarrhenae (%，n＝2)

提取率（%）＝[水提液中成分的濃度（mg·mL－1）×水提液體積（mL）]/[鹽知母中該成分的平均含量（mg·g－1）×處方中鹽知母用量（g）]×100%

結果表明復幼方中不同藥味配伍會影響新芒果苷、芒果苷和異芒果苷的提取率，復幼方合提后新芒果苷、異芒果苷提取率高于鹽知母單獨提取，芒果苷提取率低于鹽知母單獨提取，3種成分的總提取率大于鹽知母單獨提取。生地黃與鹽知母以處方比例合提對新芒果苷提取率影響最大。地骨皮與鹽知母以處方比例合提對芒果苷提取率影響最大。方中各藥味與鹽知母以處方比例配伍合提后異芒果苷溶出均增加，提取率均高于鹽知母單獨提取。生地黃與鹽知母以處方比例配伍合提后，3種成分的總提取率低于鹽知母單獨提取，方中其余藥味與鹽知母配伍合提后，3種成分的總提取率均大于鹽知母單獨提取。關黃柏、麥芽與鹽知母以處方比例配伍合提后，3種成分的總提取率大于復幼方整方合提，方中其余藥味與鹽知母配伍合提后，3種成分的總提取率均低于復幼方整方合提。

2.3 藥味配伍對3種成分穩定性的影響

為進一步考察藥味配伍對新芒果苷、芒果苷、異芒果苷穩定性的影響，將方中各藥材分別與鹽知母配伍提取，并對復幼方進行合提，水提液放冷后定容至等體積，平行操作兩份。測定不同配伍組合水提液在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h后新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的含量，取平均值。按照下式計算與0 h測得含量相比，48 h內各組水提液中的3種成分的含量，以百分比計。結果見圖3和圖4。含量（%）＝不同時間點各組樣品測得含量/0時各組樣品測得含量×100%。

圖3 不同水提液放置48 h時3種成分的含量（n＝2）Fig 3 Contents of the 3 components in different water extracts placed for 48 h（n＝2）

圖4 不同水提液放置48 h時3種成分的含量（n＝2）Fig 4 Contents of the 3 components in different water extracts placed for 48 h（n＝2）

結果表明復幼方水提液放置48 h后新芒果苷含量較穩定，芒果苷穩定性降低，含量下降15.96%，異芒果苷含量增加約23%。關黃柏-鹽知母組水提液中新芒果苷的含量下降約6%，地骨皮-鹽知母組水提液放置48 h后芒果苷、異芒果苷最不穩定，下降約8%和10%。對不同組別配伍提取后3種成分的總含量進行整體分析，夏枯草-鹽知母組和地骨皮-鹽知母組水提液中3種成分的總含量下降最明顯，分別為19.0%和20.3%。提示關黃柏、夏枯草、地骨皮可能對復幼方中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的穩定性存在影響。

3 討論

3.1 新芒果苷、芒果苷、異芒果苷在復幼方提取過程中的穩定性

知母作為清熱瀉火類中藥在臨床應用廣泛，在前期提取工藝研究中，不同溫度條件下，鹽知母中3種雙苯吡酮類成分新芒果苷、芒果苷和異芒果苷在單體溶液及鹽知母水提液中穩定性良好，而在復幼方提取過程中受溫度、加熱時間和放置時間的影響，在超過60℃的提取條件下，3種成分的含量隨加熱溫度的升高和受熱時間的延長而降低，提示復幼方在生產過程中應該注意控制溫度和受熱時間，溫度不宜過高，不宜長時間加熱且提取后不宜長時間放置。有文獻報道芒果苷在中性和微酸性條件下結構穩定，堿性條件下分子結構會發生變化[12]，測定3種雙苯吡酮類成分對照溶液、鹽知母飲片水提液、復幼方水提液的pH，結果顯示3種雙苯吡酮類成分對照品溶液pH基本一致，鹽知母水提液和復幼方水提液pH接近，分別為4.88和5.12，因此排除復幼方水提液整體pH的影響，猜測為復方中藥味配伍的作用。

3.2 復幼方藥味配伍對新芒果苷、芒果苷、異芒果苷提取率的影響

中藥復方配伍是以中醫藥學理論為指導進行臨床用藥的主要形式，藥味中的有效成分是其發揮臨床療效的物質基礎，通過現代科學技術手段探究中藥復方中有效成分的變化，對中藥復方的配伍和合理應用具有指導意義[13]。中藥復方煎煮過程中，由于藥味配伍的不同，溶液中的復雜成分可能由于形成締合物、復合物等而使提取率發生變化。在本研究中，將復幼方中各味藥材與鹽知母按處方比例一一配伍后提取，結果顯示不同的藥味配伍會影響新芒果苷、芒果苷和異芒果苷的提取率，與方中其他配伍組合相比，生地黃、地骨皮與鹽知母以處方比例配伍提取后，3種成分提取率均偏低。有文獻報道[14]，知母與堿基類中藥（地骨皮、桑白皮）、酚酸類中藥（橘紅、丹參）配伍合提，芒果苷提取率顯著降低，生物堿類成分、氨基酸類成分對芒果苷提取率均有影響，這一報道與本文研究結果相符。另有研究表明，鹽知母與關黃柏按1∶1比例配伍時，水提液中新芒果苷含量高于知母單煎，芒果苷含量降低[15]。本研究中鹽知母與關黃柏的處方比例為3∶1，3種雙苯吡酮類成分的提取率均大于鹽知母單獨提取，且異芒果苷＞芒果苷＞新芒果苷，說明不同的配伍比例同樣會對有效成分提取率造成不同的影響。

3.3 復幼方藥味配伍對新芒果苷、芒果苷、異芒果苷穩定性的影響

為進一步考察藥味配伍對3種成分穩定性的影響，將方中10味藥與鹽知母按處方比例配伍提取，并對復幼方進行全方提取，測定不同配伍組合水提液和復幼方水提液在48 h內3種成分的含量，結果表明地骨皮、夏枯草與鹽知母配伍使芒果苷、異芒果苷穩定性降低，新芒果苷在復幼方水提液中較穩定。有研究發現樣品自然發霉后產生的菌株能夠產生β-葡萄糖苷酶，使新芒果苷中β-葡萄糖鍵斷裂轉化為芒果苷[16]，復幼方水提液于室溫下放置易發霉產生沉淀，48 h后芒果苷與異芒果苷含量變化呈相反趨勢，猜測可能存在成分之間的轉化，應進一步深入研究。

3.4 小結

本研究建立的新芒果苷、芒果苷、異芒果苷HPLC含量測定方法穩定可行，通過研究復幼方中藥味配伍對3種成分提取率和穩定性的作用，闡明不同的藥味配伍及配伍比例是影響復幼方中有效成分含量的關鍵因素。中藥之間復雜的配伍作用不僅會對提取率造成影響，還會影響復方中有效成分在溶液中的穩定性?？筛鶕l揮藥效的有效成分不同，對藥味配伍及配伍比例進行科學地調整，使復方發揮更好的功效。