基于藥代動力學研究厚樸-苦杏仁配伍在大鼠體內的相互作用

王星晨，勾楠，鄭東梅，3，蓋守昌，張瑩，劉星星，劉雪英*，王慶偉，3*（.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 706；.安康市中醫醫院，陜西 安康 7000；3.空軍軍醫大學第二附屬醫院藥劑科，西安 70038；.空軍軍醫大學藥學系藥物化學與藥物分析學教研室，西安 7003；.西安培華學院，西安 70）

《傷寒論》中記載“喘家作桂枝湯，加厚樸杏子佳”，方中厚樸降氣，苦杏仁下氣，相須為用，共治肺氣上逆。 《中華醫方精選辭典》中顯示厚樸、苦杏仁常配伍使用[1-3]，其中含有厚樸的方劑815首，組方用藥涉及293種，化痰止咳平喘藥累計用藥385次，與杏仁配伍頻次有33次[4]?！吨嗅t臨床常用對藥配伍》中有提到杏仁苦溫多脂、潤肺利氣、外達肌腠；厚樸辛苦溫，辛散苦泄、降氣除螨、溫通肌腠，兩藥合用降氣定喘[5]。兩味藥也是中藥復方制劑定喘止咳糖漿的主要組分，臨床上于常用來治療咳嗽、哮喘等肺部疾病。多篇文獻報道[6-8]在使用組方中采用厚樸-杏仁（1∶1）時改善了慢性阻塞性肺疾病的呼吸困難等癥狀。何劍榮[9]運用厚樸-杏仁（1∶1）的桂枝厚樸杏子湯加味治療喉源性咳嗽效果甚佳。李煥敏等[10]基于網絡藥理學研究了厚樸-杏仁治療哮喘的機制，但其協同治療的作用機制尚不明確。厚樸中的厚樸酚與和厚樸酚有抗菌、抗病毒、抗炎鎮痛等藥理作用，苦杏仁中苦杏仁苷有降氣、鎮咳平喘、增強機體免疫和潤腸通便的功效[11]，本實驗擬采用HPLC-MS/MS法，研究厚樸-苦杏仁配伍前后主要成分厚樸酚、和厚樸酚與苦杏仁苷在大鼠體內的藥代動力學變化過程，從藥代動力學角度探討兩者相須配伍規律，為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，雌雄各半，體質量（200±20）g [空軍軍醫大學動物實驗中心，動物許可證號：SCXK（軍）2014-007，動物合格證號：醫動字第08-005號]。

1.2 試藥

厚樸、苦杏仁藥材，購于西安天晟中藥飲片公司，經陜西中醫藥大學白吉慶副教授鑒定，厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd et Wils.的干燥干皮，苦杏仁為薔薇科植物山杏Prunus armeniacaL.var.ansuMaxim.的干燥成熟種子。依據2020年版《中國藥典》一部[12]，測得厚樸藥材中厚樸酚的含量為1.74%，和厚樸酚含量為0.84%，苦杏仁中苦杏仁苷含量為4.523%，均符合藥典要求。厚樸、苦杏仁飲片打粉，稱量厚樸，苦杏仁藥材約1 kg，用8倍量的75%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，旋蒸，濃縮，得厚樸浸膏0.275 kg，每克浸膏相當于原藥材得3.673 g；得苦杏仁浸膏0.250 kg，每克浸膏相當于原藥材4 g。

苦杏仁苷（批號：HA147454198）、厚樸酚（批號：HM041231198）、和厚樸酚（批號：HM041230198）（寶雞辰光生物科技有限公司，含量：98%）；卡馬西平[內標（IS），批號：100142-201706，中國食品藥品檢定研究所，含量：99.7%]；甲醇和乙腈均色譜級（美國TEDIA公司）；甲酸色譜級（廣東光華科技股份有限公司）；超純水由優普UPT系列超純水機制得。

1.3 儀器

Agilent 6460三重四級桿質譜儀、Agilent 1260液相色譜儀（美國安捷倫）；真空離心濃縮儀（北京吉艾姆公司）；高速離心機（Thermo Fisher 公司）；渦旋振蕩器（德國IKA公司）；萬分之一分析天平（上海梅特勒-托利多公司）。

2 方法與結果

2.1 HPLC-MS/MS測定方法的建立

色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×150 mm，5μm）；保護柱：C18（50 mm×4.6 mm，江蘇漢邦）；流動相：乙腈-水（含 0.1%甲酸）（88∶12，V/V）；流速：0.5 mL·min－1；洗脫時間：7 min；進樣量：5 μL；柱溫：25℃；離子源：電噴霧離子化源（ESI）；MS/MS：多反應監測（MRM），各成分及卡馬西平的保留時間tR，m/z，去簇電壓（DP）及碰撞能量（CE）如表1所示。待測物和IS的結構式見圖1。

圖1 待測物和內標的分子結構式Fig 1 Molecular structure formula of the analyte and the internal standard

表1 分析物及內標的 MRM 檢測參數Tab 1 MRM detection parameter of the analyte and the internal standard

2.2 對照品溶液制備

精密稱量厚樸酚、和厚樸酚、苦杏仁苷和IS對照品各10.0 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL棕色量瓶中，得質量濃度為1.0 mg·mL－1的各對照品儲備液。分別精密吸取各對照品儲備液，用甲醇稀釋，配制厚樸酚質量濃度為100.0、500.0、1000.0、5000.0、10 000.0、20 000.0 ng·mL－1，和厚樸酚質量濃度為50.0、100.0、500.0、1000.0、5000.0、10 000.0 ng·mL－1，苦杏仁苷質量濃度為100.0、500.0、1000.0、5000.0、10 000.0、20 000.0 ng·mL－1的系列對照品溶液。IS溶液用甲醇稀釋到 100.0 ng·mL－1，所有溶液于－20℃冰箱保存。

2.3 大鼠血漿樣品的處理

取大鼠血漿100 μL，加入IS溶液10 μL，渦旋振蕩10 min，加入乙腈1000 μL沉淀血漿蛋白，再渦旋振蕩10 min后，20 000×g離心15 min，移取上清液800 μL，于37℃下真空離心濃縮儀吹干，80 μL流動相復溶，渦旋振蕩10 min，20 000×g離心15 min，吸取上清液5 μL進行分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線的建立 取“2.2”項下系列對照品溶液10 μL于離心管中，真空離心濃縮后，分別加入到100 μL空白血漿，按“2.3”項下方法操作。利用液質聯用中的Masshunter定量軟件計算，求各成分的直線回歸方程。厚樸酚線性范圍：10.0～2000.0 ng·mL－1，線性方程為Y＝0.0003X－0.0018，R2＝0.9996；和厚樸酚線性范圍：5.0～1000.0 ng·mL－1，線性方程為Y＝0.0026X－0.1136，R2＝0.9969；苦杏仁苷線性范圍：10.0～2000.0 ng·mL－1，線性方程為Y＝0.0003X＋0.221，R2＝0.9966。每批測試樣品建立隨行標準曲線，R2＞0.99時該方法方可以使用。

2.4.2 檢測限和定量限 分別取含不同質量濃度厚樸酚、和厚樸酚、苦杏仁苷的血漿樣品，逐步稀釋，按“2.3”項下方法進行處理，HPLC-MS/MS分析，測定信號與噪音信號的比值，信噪比S/N≥3時的量為檢測限（LOD），信噪比S/N≥10時的量為定量限（LOQ）。結果厚樸酚、和厚樸酚與苦杏仁苷的定量限分別為10.0、5.0、10.0 ng·mL－1，檢測限分別是5.0、2.5、5.0 ng·mL－1，RSD均＜15%（n＝6）。

2.4.3 專屬性考察 取空白大鼠血漿100 μL，作為空白樣品；空白血漿100 μL中分別加入IS、厚樸酚、和厚樸酚和苦杏仁苷作為對照品；取給藥2 min后的大鼠血漿100 μL，加入IS作為樣品。以上血漿樣品按照 “2.3”項下方法處理并測定，色譜圖如圖2所示。

圖2 厚樸-苦杏仁配伍的LC-MS色譜圖Fig 2 Liquid chromatography/tandem mass spectrometry chromatogram of Magnolia Officinalis Cortex and Armeniacae Semen Amarum

2.4.4 精密度和準確度 制備定量下限、低、中、高質量濃度的血漿樣品溶液（厚樸酚：10.0、20.0、1000.0、1500.0 ng·mL－1；和厚樸酚：5.0、10.0、500.0、750.0 ng·mL－1；苦杏仁苷：10.0、20.0、1000.0、1500.0 ng·mL－1）， 按“2.3”項下方法處理，平行6份。同時建立隨行標準曲線，連續進樣3 d，計算精密度（RSD）和準確度（RE）。結果顯示RSD均小于7.3%，RE均在－13.33%～8.03%。說明該方法的精密度和準確度符合生物樣品分析的要求，結果見表2。

表2 精密度與準確度Tab 2 Precision and accuracy

2.4.5 穩定性 制備低、中、高質量濃度的血漿樣品溶液（厚樸酚：20.0、1000.0、1500.0 ng·mL－1；和厚樸酚：10.0、500.0、750.0 ng·mL－1；苦杏仁苷：20.0、1000.0、1500.0 ng·mL－1），每個濃度6份，按“2.3”項下處理后的血漿樣品于4℃冰箱中24 h，－20℃凍存30 d，室溫中12 h，凍融循環3次，在以上幾個條件下考察穩定性，結果樣品的穩定性范圍是85.89%～104.64%。

2.4.6 回收率 配制對照品（厚樸酚：20.0、1000.0、1500.0 ng·mL－1；和厚樸酚：10.0、500.0、750.0 ng·mL－1）；苦杏仁苷：20.0、1000.0、1500.0 ng·mL－1，按“2.3”項下步驟處理進樣。另取空白血漿100 μL，加入上述各質量濃度對照品和IS溶液（100.0 ng·mL－1）各10 μL，按“2.3”項下步驟操作，于真空離心濃縮儀吹干，復溶，進樣測定，結果提取回收率在86.45%～102.45%，RSD為1.1%～4.3%，符合要求。

2.4.7 基質效應 取大鼠空白血漿100 μL，按照“2.3”項下方法制備含厚樸酚20、1000、1500 ng·mL－1，和厚樸酚10、500、750 ng·mL－1，苦杏仁苷20、1000、1500 ng·mL－1的血漿樣品，每濃度配制6份，測得方法回收率在85.96%～99.32%，RSD為1.1%～6.6%。

2.5 藥代動力學研究

2.5.1 灌胃液制備 根據臨床成人常用劑量和2020年版《中國藥典》[12]厚樸的用量為3～10 g，苦杏仁的用量為5～10 g，最終選取厚樸-苦杏仁配伍用量為10 g∶10 g，換算成大鼠灌胃給藥劑量為0.9 g·kg－1，則厚樸組浸膏、苦杏仁組浸膏為0.225 g·kg－1，0.2451 g·kg－1，均用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解制成混懸液，配伍組同比例混合（給藥量分別為厚樸酚15.67 mg·kg－1，和厚樸酚7.57 mg·kg－1，苦杏仁苷29.01 mg·kg－1）。

2.5.2 給藥及取樣 18只SD大鼠，體質量（200±20）g，雌雄各半，隨機分為厚樸組、苦杏仁組、厚樸-苦杏仁配伍組，每組6只，實驗前禁食不禁水12 h。于給藥后2、5、10、15、30、60、120、240、360、480、720、1440 min大 鼠眼眶取血，肝素抗凝，20 000×g離心15 min，血漿凍存于－20℃。檢測前放至室溫融化。

2.5.3 統計分析 采用DAS 3.0軟件（北京博之音科技有限公司）計算藥代動力學參數，結果見表3。使用Graphpad軟件繪制濃度-時間曲線，結果見圖3，數據采用SPSS 19.0進行統計分析，對AUC（0～t）、Cmax進行單側Student 檢驗，由于tmax分布不符合正態分布，因此對tmax進行Wilcoxon秩合檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。三者的濃度-時間曲線跟所報道的基本一致[13]，與單味苦杏仁組相比，配伍后的苦杏仁苷的Cmax、AUC（0～t）以及AUC（0～∞）明顯增加（P＜0.05），CLz/F顯著下降，苦杏仁苷的t1/2和Vdz/F均有所增加。兩藥合用之后，苦杏仁苷血藥濃度大大增加，消除過程減緩。與單味厚樸組相比，配伍后厚樸酚與和厚樸酚的Cmax、AUC（0～t）明顯升高，配伍之后促進了厚樸有效成分富集在血液中，厚樸酚CLz/F、Vdz/F顯著降低，和厚樸酚CLz/F下降，配伍給藥后在大鼠體內厚樸酚與和厚樸酚的清除率減少。

表3 大鼠灌服厚樸、苦杏仁和厚樸-苦杏仁浸膏后厚樸酚、和厚樸酚與苦杏仁苷的藥代動力學參數(±s，n＝6)Tab 3 Pharmacokinetic parameter of magnolol，honokiol and amygdalin after administration of Magnolia Officinalis Cortex and Armeniacae Semen Amarum and compatibility extracts in rats (±s，n＝6)

表3 大鼠灌服厚樸、苦杏仁和厚樸-苦杏仁浸膏后厚樸酚、和厚樸酚與苦杏仁苷的藥代動力學參數(±s，n＝6)Tab 3 Pharmacokinetic parameter of magnolol，honokiol and amygdalin after administration of Magnolia Officinalis Cortex and Armeniacae Semen Amarum and compatibility extracts in rats (±s，n＝6)

注：與單味給藥組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：vs single dose group，*P＜0.05，**P＜0.01.

Cmax/（ng·mL－1）厚樸酚 厚樸 77.49±25.76 92.49±31.79 542.4±105.1 21.7±9.3 0.2±0.1 141.2±32.1 184.4±85.3厚樸-苦杏仁 237.7±129.5* 313.2±200.6* 615.4±290.6 29.2±17.4 0.1±0.0** 52.0±28.5**1025.7±600.7**和厚樸酚 厚樸 33.26±13.63 52.91±27.45 809.7±435.1 25.0±7.7 0.2±0.1 207.0±201.1 91.9±38.6厚樸-苦杏仁 64.65±20.18* 94.52±37.10 968.6±322.6 26.7±8.2 0.1±0.0 114.6±19.4 235.6±81.4**苦杏仁苷 苦杏仁 91.89±23.51 100.6±23.62 219.9±57.4 24.2±9.2 0.3±0.1 92.5±15.9 379.7±67.6厚樸-苦杏仁 261.0±183.7* 333.7±187.3* 727.1±573.4 20±19.7 0.1±0.1** 121.2±103.4 1016.1±462.7*有效成分 組別 AUC（0～t）/（mg·min·mL－1）（mg·min·mL－1） t1/2/min tmax/min CLz/F/L/（min·kg）AUC（0～∞）/Vdz/F/（L·kg－1）

圖3 厚樸酚、和厚樸酚與苦杏仁苷單味與配伍給藥前后濃度-時間曲線Fig 3 Plasma concentration-time curves of magnolol，honokiol and amygdalin before and after the combination administration

3 討論

本實驗建立了同時測定SD大鼠血漿中厚樸酚、和厚樸酚與苦杏仁苷的HPLC-MS/MS法。前期研究中發現苦杏仁苷適用于480.3→ 347.1（[M＋Na]＋）和475.2 →163.0（[M＋NH4]＋）兩個條件，但后者的響應值比前者好。實驗前期選用了甲醇和乙腈作為有機相，對比發現，在使用乙腈作為有機相時，厚樸酚與和厚樸酚的保留時間相對較短，峰形良好，在水相中加入0.1% 的甲酸，分離效果提高，故選用乙腈-水（含 0.1%甲酸）（88∶12，V/V）為流動性，等度洗脫。預實驗選取了甲醇和乙腈兩種蛋白沉淀劑，因乙腈作為流動相，可以有效減少溶劑化效應，且沉淀率高最終選擇乙腈作為沉淀劑。其方法學驗證符合生物樣品定量分析指導原則[14]和2020年版《中國藥典》[15]。

前期研究者通過研究單味與配伍給藥前后在大鼠體內的藥代動力學參數變化，證明了配伍藥物之間相互作用的物質基礎[16-17]。厚樸酚與和厚樸酚為同分異構體，和厚樸酚結構兩苯環的夾角大于厚樸酚的兩苯環夾角，化學結構差異決定了兩者在動物體內的藥代動力學性質不同[18]。有研究表明厚樸酚與和厚樸酚的溶解性差和生物利用度不高主要原因是胃腸道吸收差[19-20]，和厚樸酚在腸液堿性環境中不穩定，其化學結構可能在胃腸道內發生了轉化。厚樸酚與和厚樸酚自身具有抵制被肝微粒體代謝的能力[21]。而苦杏仁苷的代謝主要由腸道菌群代謝[22]，芍藥苷和苦杏仁苷通過抑制細胞色素P450亞型的CYP2C9和CYP2E1的活性，導致其他藥物的代謝速度減慢，血漿中藥物濃度增加，作用時間延長[23]；也有學者通過體外實驗證明5、10、25、50 μmol·L－1厚樸酚和與厚樸酚在孵育30 min后對細胞色素P450亞型CYP2C、CYP2D6、CYP2E1、CYP2B6均有明顯的抑制作用[24]。本研究發現在厚樸與苦杏仁配伍后，厚樸酚，和厚樸酚與苦杏仁苷發生了藥動學相互作用，厚樸酚、和厚樸酚與苦杏仁苷有可能抑制了CYP2E1或CYP450的其他亞型，減緩了這3種有效成分的代謝，使有效成分在血液中的含量增大，延長了藥物的體內滯留時間，從而提高了厚樸酚、和厚樸酚與苦杏仁苷的生物利用度。增強了厚樸和苦杏仁的藥物作用，同時也印證了厚樸和苦杏仁相須為用，相輔相成，協同增效。后續我們將通過大鼠組織分布實驗進行更深入的探討。