沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片的制備與釋藥機制研究

程曼曼，施沁青，王菁華，尹莉芳，秦超，韓曉鵬（中國藥科大學藥學院藥劑系，南京 210009）

心力衰竭（heart failure，HF）是由心室充盈或射血的任何結構或功能受損所致的一種復雜的臨床綜合征[1]。心力衰竭是一類患病率高、再住院率高、死亡率高的疾病，其嚴重影響患者的生活質量和生命，是一個日益嚴重的公共衛生問題。據統計，全球心力衰竭患者的數量已高達2300萬，僅在美國就有約650萬患者，并且大約50%的病例是射血分數降低的心力衰竭[2]。盡管目前心力衰竭的治療有了較大的進展，但其發病率和死亡率仍非常高（患者的5年生存率為50%，10年生存率為10%），醫療支出仍較高（全球每年用于心力衰竭上的費用為1080億美元，2012年美國用于心力衰竭的費用約為300億美元[3]）。沙庫巴曲纈沙坦鈉（sacubitril/valsartan，LCZ696）是由諾華制藥公司開發的治療慢性心力衰竭的創新藥物，與依那普利相比，其使心血管疾病死亡率和首次住院率降低了20%，是首個也是唯一一個較標準治療顯著改善心力衰竭患者預后的藥物[4-5]。2015年7月沙庫巴曲纈沙坦鈉通過FDA和歐盟審批上市，于2017年和2020年進入中國和日本市場，目前已被各國心力衰竭治療指南推薦為慢性心力衰竭的一線治療藥物。

LCZ696由沙庫巴曲和纈沙坦按物質的量1∶1共結晶形成，是FDA批準的第一個藥物共晶體，有效提高了纈沙坦的生物利用度[6]。LCZ696具有同時阻斷血管緊張素受體和抑制腦啡肽酶的雙重作用機制，沙庫巴曲（AHU377，前藥）可由酯酶快速代謝為活性成分腦啡肽酶抑制劑（LBQ657），起到排鈉利尿、舒張血管等作用；纈沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑，起到改善水鈉潴留、減輕心臟負荷等作用[7-8]。2017年沙庫巴曲纈沙坦鈉片（Entresto，諾欣妥）全球銷售額為5.07億美元，2018年全球銷售額為10.28億美元，處于飛速增長期，臨床需求量大。目前僅有原研廠家諾華上市的普通片劑型，規格分別為50 mg、100 mg和200 mg，日服2次。而慢性心力衰竭患者需長期服藥，給藥順應性差，且其臨床試驗表明患者服用該藥物后有低血壓、高血鉀等不良反應。因此將沙庫巴曲纈沙坦鈉制備成日服一次的緩釋骨架片，可在體內緩慢平穩的釋放藥物，從而有效避免血壓過度波動，發揮最佳治療效果。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

沙庫巴曲纈沙坦鈉原料藥（含量：100.8%，山東四環藥業股份有限公司）；羥丙甲基纖維素（HPMC）、聚氧乙烯（PEO N60K）、歐巴代ambⅡ薄膜包衣預混劑（卡樂康包衣技術有限公司）；羥丙基纖維素（HPC MXF，亞什蘭公司）；卡波姆（971PNF，路博潤特種化工有限公司）；海藻酸鈉（500～800 mPa·s，青島明月海藻有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，亞什蘭公司）；無水乳糖（德國美劑樂公司）；甘露醇（法國羅蓋特公司）；微晶纖維素（德國JRS藥用輔料公司）；硬脂酸鎂（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；微粉硅膠（上海風泓藥用輔料技術有限公司）；乙腈（美國天地，色譜純）；三氟乙酸（阿拉丁，色譜純）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

AR223CN千分之一天平（OHAUS公司）；XS105DU十萬分之一天平[梅特勒-托利多（常州）精密儀器有限公司]；pH計（北京賽多利斯科技儀器有限公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（SHIMADZU公司）；FADT-1200RC溶出儀（上海富科思分析儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；旋轉壓片機（北京新龍立科技有限公司）；YPD-200C片劑硬度測定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 釋放度測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（GL Inertsil ODS-3，4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動相：水-乙腈-三氟乙酸（500∶500∶1）；檢測波長：255 nm；流速：2.0 mL·min－1；進樣溫度：25℃；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL。

2.1.2 釋放度的測定 按照2020年版《中國藥典》四部通則0931第二法（槳法）[9]，以pH 6.8的磷酸鹽緩沖液為溶出介質，體積為900 mL，轉速為50 r·min－1，溫度（37.5±0.5）℃，依法操作，分別于1、2、4、6、8 h取樣10 mL，并及時補加同溫等體積溶出介質，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。按外標法分別計算不同時間點樣品中沙庫巴曲和纈沙坦的濃度，并計算沙庫巴曲和纈沙坦的累積釋放度。

2.1.3 系統適用性 按“2.1.1”項下色譜條件，取“2.1.2”項下供試品溶液進樣檢測，結果纈沙坦的保留時間為3.908 min，理論板數為10 772，拖尾因子為1.120；沙庫巴曲的保留時間為5.170 min，理論塔板數為12 858，拖尾因子為1.100。取供試品溶液連續進樣6次，記錄峰面積，結果纈沙坦峰面積RSD為0.030%，沙庫巴曲峰面積RSD為0.15%，精密度符合要求。

2.2 原料藥在各介質中平衡溶解度的測定

纈沙坦是BCS Ⅱ類（低溶高滲）的弱酸性藥物，其在不同pH值介質中的平衡溶解度結果見表1，結果顯示纈沙坦在水中幾乎不溶，在不同pH值介質中的平衡溶解度具有pH依賴性，隨著pH值升高纈沙坦平衡溶解度增大。共晶中纈沙坦在不同pH值介質中的平衡溶解度均大于纈沙坦單藥。

表1 纈沙坦和沙庫巴曲纈沙坦鈉在不同pH值介質中的平衡溶解度Tab 1 Equilibrium solubility of valsartan and sacubitril/valsartan in media with different pH values

2.3 原料藥穩定性

按《化學藥物（原料藥和制劑）穩定性研究技術指導原則》要求開展原料藥影響因素試驗。將沙庫巴曲纈沙坦鈉原料藥平鋪于敞口稱量瓶中，厚度小于3 mm，分別放置在高溫60℃、高濕92.5% RH和光照[照度（4500±500）Lx]條件下，于10 d、30 d取樣，觀察性狀，測定有關物質變化情況（有關物質方法參照沙庫巴曲纈沙坦鈉片進口藥品注冊標準JX20150417），結果見表2。結果表明，沙庫巴曲纈沙坦鈉在上述條件下化學性質穩定，有關物質無明顯變化；高濕92.5%RH條件下藥物吸濕明顯，原料藥應在干燥密封條件下儲存。

表2 原料藥穩定性結果Tab 2 Stability of drug substance

2.4 制備工藝考察

沙庫巴曲纈沙坦鈉原料藥易潮解、流動性較差，且在處方中比例較大，不易采取粉末直壓工藝，因此考慮濕法制粒和干法制粒工藝制備緩釋片。由于沙庫巴曲纈沙坦鈉為共晶藥物，在制備過程中可能會使原料藥晶型發生轉變，因此測定不同制粒方式下顆粒的X射線粉末衍射，見圖1。結果顯示自制緩釋片（干法制粒、濕法制粒）和原料藥在相同位置有明顯衍射峰，表明制備工藝未引起原料藥晶型改變。此外不同制粒工藝制得緩釋片在pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液中纈沙坦和沙庫巴曲的釋放均無明顯差異（見圖2）。由于干法制粒顆粒得率低，且顆粒流動性差，因此最終選擇濕法制粒工藝為緩釋片制備工藝，其制備工藝如下：按處方用量稱取沙庫巴曲纈沙坦鈉原料藥、無水乳糖、HPMC K4M和HPMC K100LV，按等量遞增法混合均勻。加入適量無水乙醇，制軟材，過20目篩濕整粒，經40℃干燥2 h后，過20目篩干整粒，按照處方量稱取硬脂酸鎂和微粉硅膠，混合均勻后，將總混顆粒用旋轉壓片機壓制成硬度在8～10 kg·cm－2的片芯。采用amb Ⅱ型薄膜包衣粉進行包衣，物料溫度約40～45 ℃，包衣鍋轉速15 r·min－1，噴液速度約1 g·min－1，薄膜衣增重4%～5%。

圖1 原料藥、空白輔料和緩釋片的X-射線粉末衍射測定圖Fig 1 X-ray diffraction of API，the blank excipient and sustainedrelease tablets

圖2 不同制備工藝對藥物釋放行為的影響Fig 2 Effect of different preparation methods on drug release behaviors A.纈沙坦（valsartan）；B.沙庫巴曲（sacubitril）

2.5 處方單因素考察

2.5.1 骨架材料的考察 本研究選擇6種緩釋材料作為親水凝膠骨架材料，分別為羥丙甲基纖維素（HPMC K100LV）、卡波姆971PNF、海藻酸鈉、CMC-Na、PEO N60K、HPC MXF，用量占片芯質量的25%，按照“2.4”項下方法制備緩釋片，纈沙坦釋放曲線見圖3A，沙庫巴曲釋放曲線見圖4A。結果顯示，骨架材料種類相同時，纈沙坦的釋放較沙庫巴曲的釋放略快。當緩釋材料用量固定為25%時，6種骨架材料均有不同程度的緩釋作用，卡波姆971PNF的緩釋效果最明顯，CMC-Na的緩釋效果次之，HPC MXF 和PEO N60K緩釋效果相當，HPMC K100LV和海藻酸鈉的緩釋效果最小。因HPC MXF、PEO N60K和CMC-Na形成的凝膠層較厚，纈沙坦和沙庫巴曲的8 h釋放約60%左右，使用過程中可能存在釋放不完全的問題。當使用卡波姆971PNF作為骨架材料時，物性太黏，使用低比例就能產生較強的緩釋效果，在工業放大生產時耐用性較差；HPMC是一種全能型的緩控釋聚合物材料，作為親水凝膠骨架材料在骨架片中應用較為廣泛，目前HPMC有多種黏度型號可供選擇，具有安全無毒、價格低廉、成型性好、釋放易調節等諸多優點，因此本研究選用HPMC作為骨架材料。

2.5.2 HPMC型號的考察 分別選用4種不同黏度型號的羥丙甲基纖維素（K100LV、K4M、K15M、K100M）作為骨架材料，用量占片芯質量的25%，按照“2.4”項下方法制備緩釋片，纈沙坦釋放曲線見圖3B，沙庫巴曲釋放曲線見圖4B。結果顯示，黏度型號相同時，纈沙坦的釋放較沙庫巴曲的釋放略快。當骨架材料為低黏度型號K100LV時，由于其黏度較低，骨架片溶蝕較快，藥物釋放也較快，骨架在試驗過程中不能保持完整，緩釋效果較差；當骨架材料為高黏度型號K100M、K15M、K4M時，由于高黏度的HPMC形成的凝膠層的分子鏈較長，形成凝膠層較厚，骨架溶蝕較長，藥物的釋放依次變快。

2.5.3 HPMC用量的考察 本研究考察單獨使用HPMC K100LV和HPMC K4M時，不同HPMC用量對藥物釋放的影響，纈沙坦釋放曲線見圖3C，沙庫巴曲釋放曲線見圖4C。結果顯示，在研究用量范圍內，單獨使用HPMC K100LV作為骨架材料時，纈沙坦和沙庫巴曲在前期釋放均較快，產生突釋現象，骨架不能保持完整的外形，緩釋效果較差；當單獨使用HPMC K4M作為骨架材料時，隨著用量的增加，纈沙坦和沙庫巴曲的釋放均減慢，在研究用量范圍內8 h纈沙坦和沙庫巴曲累計釋放度低于80%，釋放不完全。單一規格的HPMC在一定程度上能使許多藥物緩慢釋放，但是很難達到平穩釋藥且釋藥速率調節不夠靈活[10-12]，因此本研究聯合使用HPMC K4M和HPMC K100LV作為二元骨架材料制備沙庫巴曲纈沙坦緩釋片。

2.5.4 填充劑種類的考察 分別選用無水乳糖、甘露醇和微晶纖維素為填充劑，用量為25%，保持其他條件不變，按“2.4”項下方法制備緩釋片，纈沙坦曲線結果見圖3D，沙庫巴曲釋放曲線見圖4D。結果顯示，填充劑相同時，纈沙坦的釋放較沙庫巴曲的釋放略快，填充劑的種類對纈沙坦和沙庫巴曲的釋放幾乎無影響。因無水乳糖可壓性和流動性好，性質穩定，壓成的藥片光潔美觀，選擇無水乳糖為填充劑。

2.5.5 潤滑劑用量的考察 為了增加顆粒的流動性，防止壓片過程中出現黏沖，本研究選用硬脂酸鎂和微粉硅膠作為潤滑劑，潤滑劑用量分別為片重的2%、3%、4%，保持其他條件不變，按“2.4”項下方法制備緩釋片，纈沙坦釋放曲線見圖3E，沙庫巴曲釋放曲線見圖4E。結果顯示，潤滑劑用量對纈沙坦和沙庫巴曲的釋放幾乎無影響，當潤滑劑用量2%，壓片過程中出現輕微黏沖現象，當潤滑劑用量為3%時可起到較好的潤滑作用，故將潤滑劑用量定為3%。

2.5.6 硬度的考察 分別選用5～7 kg·cm－2、8～10 kg·cm－2、11～13 kg·cm－2的硬度制備緩釋片，纈沙坦釋放曲線見圖3F，沙庫巴曲釋放曲線見圖4F。結果顯示，在研究范圍內片芯硬度對藥物的釋放影響較小，硬度在5～7 kg·cm－2時，片劑表面粗糙且脆碎度較大，不利于后續薄膜包衣；硬度在8～10 kg·cm－2時，片劑光滑美觀且脆碎度滿足要求，因此，本研究將片劑硬度范圍定為8～10 kg·cm－2。

圖3 不同因素對纈沙坦釋放行為的影響Fig 3 Effect of different factors on the release behaviors of valsartan

圖4 不同因素對沙庫巴曲釋放行為的影響Fig 4 Effect of different factors on the release behaviors of sacubitril

2.6 中心復合設計-效應面法優化處方

2.6.1 試驗設計 經單因素考察可知，聯合應用HPMC K100LV和HPMC K4M能更好地控制藥物釋放。因此，本文以HPMC用量（X1，%）和HPMC K100LV占HPMC的比例（X2，%）為考察對象，選取各處方纈沙坦在pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液中2、6、8 h 的累積釋放度作為評價指標，利用二因素五水平中心復合設計-效應面法篩選沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片最優處方，因素水平見表3，試驗結果見表4。

表3 中心復合設計試驗中的變量水平Tab 3 Variable levels in central composite design test

表4 中心復合設計試驗中的自變量(X)和因變量(Y)Tab 4 Independent variable (X) and dependent variable (Y) in central composite design test

2.6.2 二次回歸模型的建立 利用軟件Design-Expert 10.0對表4試驗數據進行回歸分析，得二次多元回歸模型。模型①Y2h＝27.22－11.24X1＋2.62X2－2.78X1X2＋7.29X1

2－0.064X22（r＝0.9257）；模型②Y6h＝64.61－17.13X1＋5.86X2－0.97X1X2＋5.81X12＋2.30X22（r＝0.9651）；模型③Y8h＝78.97－13.58X1＋4.80X2＋2.35X1X2＋1.41X12＋1.49X22（r＝0.8994）。各方程對應的3D效應面圖見圖5。

圖5 自變量X1、X2與因變量Y2 h、Y6 h、Y8 h的3D效應面圖Fig 5 Response surface plot showing the effect of X1 and X2 on Y2 h，Y6 h， and Y8 h

2.6.3 方差分析和顯著性檢驗 由以上3個擬合方程的相關系數可知模型擬合程度良好，可以用此模型對沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片處方進行分析和預測。從表5回歸系數的顯著性檢驗可知，模型①中X1、X2、X12項顯著，其他項不顯著；模型②中X1、X2、X12項顯著，其他項不顯著；模型③中X1、X2項顯著，其他項不顯著。

表5 方差分析結果Tab 5 ANOVA

2.6.4 效應面優化與預測 根據《化學藥物口服緩釋制劑藥學研究技術指導原則》規定緩釋片的體外釋放要求，選取各處方纈沙坦在 2、6、8 h共3個點的累積釋放度作為評價指標，釋放度標準分別為2 h：25%～35%；6 h：65%～80%；8 h：不低于85%。設定處方的優化條件為：25%≤Y2h≤35%，65%≤Y6h≤80%，Y8h≥85%，軟件綜合評價后給出的最佳處方：HPMC用量（X1）為25%，HPMC K100LV比例（X2）為71%，即最優處方為沙庫巴曲/纈沙坦 400 mg，HPMC K100LV 用量18%，HPMC K4M用量7%，無水乳糖用量25%，硬脂酸鎂用量1.5%，微粉硅膠用量1.5%，按照“2.4”項下方法制備3批緩釋片，并按照“2.1”項下方法測定各時間點纈沙坦的累積釋放度，結果見表6，釋放度的預測差值小于5%，說明模型預測性良好。

表6 優化處方纈沙坦釋放度的預測值與觀測值Tab 6 Optimal formulation of predicted and observed values of valsartan release

2.7 不同釋放介質對藥物釋放的影響

沙庫巴曲在低pH介質中易降解（12 h大約降解6%），而緩釋片的釋放度試驗往往持續時間較長，因此為了避免藥物降解產生誤差，本文僅考察最優處方制備的骨架緩釋片在pH 4.5醋酸鹽緩沖溶液、pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液、水介質中的釋藥行為，纈沙坦釋放結果見圖6A，沙庫巴曲釋放結果見圖6B。結果顯示，相同介質條件下纈沙坦的釋放比沙庫巴曲略快，在不同介質中，纈沙坦和沙庫巴曲在水中的釋放最快，pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液次之、pH 4.5醋酸鹽緩沖液中最慢，藥物在不同介質中的釋放行為差異可能由于是共晶中藥物溶解性具有pH依賴性。

圖6 不同釋放介質對藥物釋放行為的影響Fig 6 Effect of different dissolution media on the drug release

2.8 釋藥模型

緩釋制劑的釋藥機制與其所用的緩釋材料具有密切關系，其釋藥過程是緩釋材料、水和藥物復雜的相互作用的結果。緩釋骨架片中藥物的釋放機制主要是藥物在凝膠層中的擴散和凝膠層的溶蝕。溶解度大的藥物，釋藥機制主要表現為擴散；溶解度小的藥物，釋藥機制主要表現為凝膠層的溶蝕，因此藥物在水中的溶解性影響骨架片的釋藥過程[13]。本文對處方優化后的沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片各指標成分在pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液中的體外釋放度數據進行零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程和Ritger-Peppas方程擬合，研究沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片的體外釋藥機制，結果見表7。

表7 沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片釋藥曲線擬合Tab 7 Release pattern of sacubitril/valsartan sustained-release tablets

結果顯示，沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片各指標成分體外釋放度數據與一級動力學模型擬合程度最高，相關系數最大；根據Ritger-Peppas方程，纈沙坦和沙庫巴曲擴散指數分別為0.8084和0.8532（介于0.45～0.89），表明沙庫巴曲纈沙坦緩釋片的釋放符合non-Fick擴散機制，即藥物既具有骨架結構的擴散，也具有骨架的溶蝕瓦解而釋放藥物的特點。

3 討論

目前國內外最常用的親水凝膠骨架材料是HPMC，其遇水后水化形成凝膠層，凝膠層的性質直接影響藥物的釋放速率，是控制藥物釋放的重要因素。不同型號的HPMC水化和溶蝕速度不同，因而控制藥物釋放的效果不同。本研究通過對HPMC的型號和用量進行篩選，最終確定以HPMC K4M和HPMC K100LV作為骨架材料制備沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片。采用中心復合設計-效應面法優化處方并量化各因素之間的相互影響，通過Design-Expert 10.0軟件綜合分析后得到了沙庫巴曲纈沙坦鈉緩釋片的最佳組成，其釋放度的預測值和實測值基本一致，說明模型預測性良好，可用于優化處方。本試驗優化后的處方體外釋放結果表明，HPMC K4M和HPMC K100LV作為沙庫巴曲纈沙坦鈉的二元親水凝膠骨架，可有效地控制藥物的釋放速度。

本研究制備的沙庫巴曲纈沙坦緩釋片工藝簡單，研發和生產成本較低，適合工業化生產，具有較大的臨床應用價值，但其體內外相關性仍需進一步研究。