巴山重樓的皂苷類化學成分研究

樊培，陸云陽，劉楊，劉文章，胡晉銘，田韻遠，李天怡，赫雪鋒，2，湯海峰*（.空軍軍醫大學藥學系中藥與天然藥物學教研室，西安 70032；2.解放軍第九六八醫院，北京 22000）

重樓屬植物屬于百合科（Liliaceae，亦有將其歸為延齡草科Trilliaceae），共有26種14余變種和若干變型，我國約有20種10余變種[1-2]。2020年版《中國藥典》收載的藥用重樓為七葉一枝花和云南重樓，主產于四川、云南、陜西等地，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚的功效，用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蟲蛇咬傷、跌撲傷痛等疾病[3]。

巴山重樓（Paris bashanensis）作為重樓屬的一種，主要分布在湖北和四川[4]，土家族通常用于頭痛、高血壓、蛇咬傷和痢疾的治療[5]。經作者實地考察，發現在陜南（大巴山北側腹地，東經109°11'～109°38'、北 緯31°42'～32°13'）也有分布。甾體皂苷是重樓的主要有效成分，但目前關于巴山重樓化學成分的研究報道有限，僅從中分離得到1個β-蛻皮激素、1個偏諾甾酮和3個偏諾皂苷[6]；此外，亦有關于其皂苷含量測定的報道，但不同報道的結果存在矛盾[7-8]，所以，對其化學成分的研究有待進一步完善。本文對巴山重樓根莖70%乙醇提取物的正丁醇萃取部位進行了化學研究，首次從中分離鑒定了7個甾體皂苷（見圖1）。

圖1 化合物1～7的化學結構Fig 1 Structures of compound 1－7

1 材料

Bruker AVANCE 800型核磁共振波譜儀（Bruker公司）；Quatrro質譜儀（Waters公司）；戴安P680高效液相色譜儀（P680系列單泵、UVVIS檢測器、CHROMELON工作站）、YMC-ActusTriart C18半制備色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）、ODS C18柱（Pharmacia公司）；Grace Reveleris X2 Flash 中低壓制備色譜儀、Sephadex LH-20凝膠（GE公司）；薄層色譜用硅膠G、柱層析色譜硅膠（100～200目、200～300目，青島海洋化工廠）；電子天平（精度：0.0001 g，賽多利斯科學儀器有限公司）；低溫冷卻循環泵（DLSB-40型，陜西愛信儀器有限公司）；隔膜真空泵（V-100 型，瑞士BUCHI公司）；旋轉蒸發儀（N-1100型）、電熱恒溫水浴鍋（OSB-2100型，上海愛朗儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（DHG-924OA型，上海一恒科學儀器有限公司）；色譜純甲醇、乙腈（天津科密歐公司）；氘代試劑（Merck 公司）；顯色劑（10%硫酸/乙醇）；其他試劑均為分析醇。

藥材于2018年9月采自陜西省安康市鎮坪縣，經空軍軍醫大學藥學系中藥與天然藥物學教研室湯海峰教授鑒定為巴山重樓（Paris bashanensisWang et Tang）的根莖，藥材標本（編號：20189013）保存在空軍軍醫大學藥學系中藥與天然藥物學教研室標本室。

2 提取與分離

干燥的巴山重樓根莖0.8 kg，用70%乙醇浸泡過夜，回流提取5次，每次2 h，減壓回收溶劑得醇提浸膏210 g。將浸膏加適量水分散，用等體積石油醚萃取5次，再用等體積水飽和正丁醇萃取6次，回收正丁醇層得到總皂苷160 g。總皂苷經硅膠柱色譜，用V二氯甲烷∶V甲醇∶V水（80∶1∶0～65∶35∶10）梯度洗脫，得到25個組分（Fr.1～Fr.25）。其中 Fr.18（17.6 g）經Sephadex LH-20凝膠柱色譜除去水溶性雜質后，再經反相硅膠柱色譜，V甲醇∶V水（80∶20～40∶60，v/v）梯度洗脫，得到Fr.18-1～Fr.18-3。Fr.18-1通過半制備高效液相色譜分離純化，80%甲醇洗脫得到化合物1（35.0 mg）和化合物2（9.6 mg）；Fr.18-2通過半制備高效液相色譜分離純化，65%甲醇洗脫得到化合物3（56.0 mg）、化合物4（7.0 mg）和化合物5（11.0 mg）。Fr.17（10.0 g）經Sephadex LH-20凝膠柱色譜除去水溶性雜質后，經ODS反相柱色譜，V甲醇∶V水（80∶20～40∶60）梯度洗脫得到Fr.17-1～Fr.17-2。Fr.17-1通過半制備高效液相色譜分離純化，70%乙腈洗脫得到化合物6（4.5 mg）和化合物7（5.3 mg）。

3 結構鑒定[9-18]

化合物1：白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鑒定反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。電噴霧質譜（ESI-MS）顯示其準分子離子峰為m/z1101 [M＋Na]＋（陽離子模式）和1077 [M-H]－（陰離子模式），結合化合物的13C-NMR譜（200 MHz，CD3OD）數據推斷其分子式為C52H86O23。

分析化合物的13C-NMR和DEPT譜數據，發現其共有52個碳信號，其中27個碳信號歸屬于苷元部分。在1H-NMR譜（800 MHz，CD3OD）高場區顯示5個甲基氫信號δH1.05（s）、0.85（s）、0.93（d，J＝7.0 Hz）、0.96（d，J＝6.8 Hz）和3.18（s），在HSQC譜中分別與δC19.8、17.6、9.8、17.2和47.5信號相關。NMR分析表明：化合物1的結構中還存在1個連氧亞甲基[δH3.39（m），3.74（t，J＝9.4 Hz）；δC75.9]、1個連氧次甲基（δH3.97；δC90.7）、1個三取代雙鍵（δH5.38；δC122.6，δC141.8）、3個季碳（δC37.9、46.1和91.6）和1個半縮醛季碳（δC114.6）。通過HSQC、1H-1H COSY、HMBC、TOCSY分析，對苷元的碳氫信號進行了歸屬，結果見表1。在HMBC譜中，H-6（δH5.38）與C-5（δC141.8）之間的遠程相關信號，表明存在雙鍵Δ5（6），甲氧基氫δH3.18信號與C-22（δC114.6）信號的遠程相關峰表明OCH3連接于C-22位。在NOESY譜中，H-5/H-9和H-5/H-3的NOE相關峰表明H-3是α構型，H-18/H-20和H-21/OCH3的NOE相關峰表明21-CH3和22-OCH3為α構型，H-14/H-16和H-16/OCH3的NOE相關峰推斷H-14為α構型。通過H2-26化學位移值（δH3.78和3.43）的差異（ΔδH＝0.35＜0.48），可確定25R構型[18]。綜合以上分析，確定1的苷元為22α-甲氧基-（25R）-呋甾-5-烯-3β，17α，26-三醇。

表1 化合物1～7的13C-NMR數據(200 MHz，1 in CD3OD，2～7 in C5D5N)Tab 1 13C-NMR data of compounds 1～7 (200 MHz，1 in CD3OD，2～7 in C5D5N)

取化合物11.5 mg加入2 mL三氟乙酸（2 mol·L－1），于120℃下加熱2 h，蒸干溶劑，向反應物中加入CH2Cl2和H2O進行萃取。蒸干水層，向殘留物中加入1 mL無水吡啶和2 mLL-半膀胱氨酸甲酯鹽酸鹽的無水吡啶溶液（0.1 mol·L－1），60℃加熱2 h，氮氣吹干；加入1 mL吡啶和0.5 mLN-（三甲基硅基）咪唑，60℃加熱1 h；蒸干溶液，用正己烷和水萃取，正己烷層進行GC分析。標準糖用同樣方法制備單糖衍生物作為對照。經分析，確定化合物1的單糖組成為D-葡萄糖和L-鼠李糖（1∶1）。在13C-NMR譜中顯示4個糖的端基碳信號δC100.3、102.2、102.8和104.5，與1H-NMR譜中的端基氫信號δH4.51（d，J＝8.9 Hz）、5.21（d，J＝1.6 Hz）、4.87（d，J＝1.3 Hz）和4.25（d，J＝8.5 Hz）分別對應。由GlcⅠ和GlcⅡ的端基氫耦合常數可知2個葡萄糖形成的苷鍵均為β構型；RhaⅠ和RhaⅡ的C-5化學位移分別為δC69.7和69.5，可知2個鼠李糖形成的苷鍵均為α構型[9-10]。通過HMBC分析發現H-3（δH3.70）與GlcⅠC-1（δC104.5）存在遠程相關，說明GlcⅠ連接于苷元C-3位；RhaⅠH-1（δH5.21）與GlcⅠC-2（δC79.3）的遠程相關，以及RhaⅡH-1（δH4.87）與GlcⅠC-4（δC79.7）的遠程相關，表明RhaⅠ和RhaⅡ分別連接于GlcⅠ的2位和4位；H-26（δH3.78）與GlcⅡC-1（δC100.3）的遠程相關信號，表明GlcⅡ連接于C-26位。與文獻[11]報道的化合物lycianthoside A的波譜數據進行對照，基本一致，從而確定化合物1為lycianthoside A。

化合物2：白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鑒定反應呈陽性，初步判斷該化合物是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z1085[M＋Na]＋（陽離子模式）和1061[M-H]－（陰離子模式）。結合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）推斷其分子式為C52H86O22。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）高場區中存在5個甲基氫信號δH1.05（s）、0.85（s）、0.93（d，J＝7.04 Hz）、0.96（d，J＝6.8 Hz）和3.18（s），分別與13C-NMR中的δC16.6、19.8、16.7、17.5和47.6信號對應。NMR分析表明，化合物2的結構中還存在1個連氧亞甲基[δH3.39（m），3.74（m）；δC75.6]、1個連氧次甲基（δH3.97；δC81.7）、1個三取代雙鍵（δH5.38；δC141.2，δC123.2）和1個半縮醛季碳（δC113.0）。在HMBC譜中H-7（δH5.42）與C-6（δC141.2）的遠程相關信號表明存在雙鍵Δ5（6）。通過2D-NMR分析歸屬了化合物2的碳氫信號，與化合物1基本一致，區別在于化合物2的C-17為不連氧的叔碳，這表明其17位無羥基取代；結合分子式進一步確定了這一推斷。將化合物2按照化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析表明化合物2的單糖組成同樣為D-葡萄糖和L-鼠李糖（1∶1）；NMR分析表明糖基部分的碳氫信號與化合物1一致。因此，確定了化合物2的化學結構，即已知化合物methylprotodioscin，波譜數據與文獻報道一致[12]。

化合物3：白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鑒定反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z907 [M＋Na]＋（陽離子模式）和883[M-H]－（陰離子模式），結合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）譜推斷其分子式為C45H72O17。13C-NMR和DEPT譜分析表明，該化合物45個碳信號中有27個碳信號歸屬于苷元部分。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）譜高場區中存在4個甲基氫信號δH1.09（s）、0.69（s）、1.24（d，J＝7.1 Hz）和0.96（d，J＝5.8 Hz），分別與13C-NMR中δC20.0、17.6、10.3和17.8信號對應。化合物3的NMR譜中還存2個季碳信號（δC37.6，45.6）和1組三取代烯烴信號（δH5.30；141.2和δC122.3）。HMBC中H-6（δH5.31）與C-5（δC141.2）顯示遠程相關，表明存在雙鍵Δ5（6）；CH3（δH1.24）與C-20（δC45.3）的遠程相關峰則表明21-CH3連接于C-20位。化合物3的A環～D環NMR數據與化合物1基本一致，但δC67.2（C-26）和110.3（C-22）等關鍵信號表明化合物3存在F環的閉環。經文獻對照，確定化合物3的苷元是常見的偏諾皂苷元[13]。

將化合物3按照化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析確定其單糖組成為D-葡萄糖和L-鼠李糖（1∶2）。13C-NMR譜顯示3個糖的端基碳信號δC100.7、102.5和103.4，與1H-NMR譜中3個端基氫信號δH4.94（d，J＝9.7 Hz）、5.96（d，J＝2.3 Hz）和5.47（d，J＝1.7 Hz）分別對應。通過HMBC譜分析確定了糖的連接方式，H-3（δH3.86）與GlcⅠC-1（δC100.7）的遠程相關信號表明GlcⅠ連接于苷元C-3位，RhaⅠH-1（δH5.96）與GlcⅠC-2（δC78.4）的遠程相關，以及RhaⅡH-1（δH5.47）與GlcⅠC-4（δC79.0）的遠程相關表明RhaⅠ和RhaⅡ分別連接于GlcⅠ的2位和4位。化合物3在糖基部分的NMR數據與化合物1的3位糖鏈一致。通過與文獻[13]中報道的化合物5的波譜數據對比，確認化合物3的化學結構為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物4：白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鑒定反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z891 [M＋Na]＋（陽離子模式）和867 [M-H]－（陰離子模式），結合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）推斷其分子式為C45H72O16。

將化合物4按照化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析確定化合物4的單糖組成為D-葡萄糖和L-鼠李糖（1∶2）。將化合物4與化合物3的NMR數據對比，發現兩者在糖鏈部分的數據一致；苷元部分的信號也基本一致，如4個甲基信號[δH1.07（s），0.85（s），1.15（d，J＝6.9 Hz），0.71（d，J＝5.7 Hz）；δC16.9，20.0，16.0，17.9）、2個季碳信號（δC37.7，41.0）、1個半縮醛碳的特征信號（δC109.8）和1組三取代烯烴信號[δH5.34（br d，J＝3.0 Hz）；δC141.3，122.3]等。但是，化合物4的C-17由δC90.6向高場位移至73.4，以及相鄰的C-13、C-16、C-20的化學位移，表明化合物4的C-17位無羥基取代，結合分子式得到驗證。經與文獻數據對照[14]，基本一致，從而確定化合物4為已知化合物borassoside E。

化合物5：白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鑒定反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z941 [M＋Na]＋（陽離子模式）和917 [MH]－（陰離子模式），結合據13C-NMR譜推斷其分子式為C45H74O19。1H-NMR譜（800 MHz，C5D5N）顯示有5個甲基氫信號δH0.86（s）、0.80（s）、0.95（d，J＝6.2 Hz）、0.98（d，J＝5.4 Hz）和3.17（s），與13C-NMR譜（200 MHz，C5D5N）中的δC15.5、13.2、14.9、15.8和47.7信號分別對應。在HMBC譜中，δH3.17信號與C-22（δC112.9）信號的遠程相關峰表明OCH3連接于C-22位，δH0.95信號與C-20（δC40.8）信號的遠程相關峰表明21-CH3連接于C-20位。上述數據與化合物1的苷元基本一致，區別在于化合物5的13C-NMR譜中無Δ5（6）信號，但多處羰基碳信號（δC213.3）。在HMBC譜中觀察到H-7（δH2.16）與該羰基碳的遠程相關信號，結合C-6周圍碳的化學位移變化分析，推斷羰基位于C-6位，從而確定了化合物5的苷元結構。

將化合物5按照化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析確定化合物5的單糖組成為D-葡萄糖和L-阿拉伯糖（2∶1）。在13C-NMR譜中存在3個糖的端基碳信號δC100.9、103.8和103.1，與1H-NMR譜的3個端基氫信號δH4.42（d，J＝8.7 Hz）、4.34（d，J＝6.1 Hz）和5.47（d，J＝7.7 Hz）相對應。通過GlcⅠ、GlcⅡ和Ara的端基氫耦合常數，確定葡萄糖形成苷鍵的相對構型均為β構型，阿拉伯糖為α構型。在HMBC譜中可見H-3（δH3.40）與GlcⅠC-1（δC100.9）的遠程相關信號，表明GlcⅠ連接于苷元C-3處；Ara H-1（δH4.34）與GlcⅠC-6（δC62.3）、以及H-26（δH3.72）與GlcⅡC-1（δC103.1）的遠程相關信號，則表明Ara連接于GlcⅠC-6，而GlcⅡ連接于苷元C-26位。與文獻報道的化合物1的波譜數據[15]比較，基本一致，從而確定化合物5的化學結構為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，26-二羥基-22-甲氧基-（25R）-5α-呋甾-6-酮-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6：白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鑒定反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z1277 [M＋Na]＋（陽離子模式）和 1253[M-H]－（陰離子模式），結合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）推斷其分子式為C58H94O29。13C-NMR和DEPT譜分析表明，該化合物58個碳信號中有28個歸屬于苷元部分。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）譜高場區中存在5個甲基氫信號δH1.38（s）、1.08（m）、0.85（s）、0.83（s）和3.15（s），分別與13C-NMR譜中的δC17.2、17.3、19.1、15.1和48.5信號對應。化合物6的NMR譜中還存在2組三取代雙鍵信號[δC140.5和121.5，δH5.38（m）；δC157.3和98.5，δH4.42（m）]。在HMBC中H-6（δH5.21）與C-5（δC140.5）顯示遠程相關，表明存在雙鍵Δ5（6）；δH0.83甲基信號與C-20（δC83.2）的遠程相關峰則表明21-CH3連接于C-20位。通過2D-NMR分析歸屬了化合物6的碳氫信號，苷元A～D環的數據與化合物2基本一致，但F環和側鏈部分存在差異。在HMBC譜中，H-23（δH4.31）與C-22（δC157.3）顯示遠程相關，表明存在雙鍵Δ22（23），而OCH3（δH3.15）與C-20（δC83.2）的遠程相關峰則表明OCH3連接于C-20位。在NOESY譜中，H-17與H-21的NOE相關峰表明C-20處的甲氧基為β構型。綜上所述，確定了化合物6的苷元結構。

將化合物6按照化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析確定其單糖組成為D-葡萄糖和D-半乳糖（4∶1）。13C-NMR譜顯示5個端基碳信號δC102.7、105.2、105.3、104.8和104.4，與1H-NMR譜5個端基氫信號δH5.55（d，J＝7.9 Hz）、5.21（d，J＝9.2 Hz）、5.20（d，J＝7.8 Hz）、5.10（d，J＝8.3 Hz）和4.98（d，J＝7.5Hz）分別對應。由GlcⅠ～GlcⅣ和Gal的端基氫耦合常數可知4個葡萄糖和半乳糖所形成的苷鍵均為β構型。通過HMBC分析發現，H-3（δH3.79）與Gal C-1（δC102.7）存在遠程相關，說明Gal連接于苷元C-3位；GlcⅠH-1（δH5.21）與Gal C-4（δC80.0）存在遠程相關，GlcⅡH-1（δH5.20）與GlcⅠC-2（δC79.2）存 在遠程相關，GlcⅢ H-1（δH5.10）與GlcⅠC-3（δC79.8）存在遠程相關，從而確定GlcⅠ連接于Gal的4位，GlcⅡ和GlcⅢ分別連接于GlcⅠ的2位和3位；H-26（δH3.68）與GlcⅣ C-1（δC104.4）的遠程相關信號，則表明GlcⅣ連接于C-26位。與文獻報道的allimacroside E的波譜數據[16]進行對照，基本一致，從而確定了化合物6的化學結構為allimacroside E。

化合物7：白色無定形粉末Lieberman-Burchard和Molish鑒定反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰m/z893 [M＋Na]＋（陽離子模式）和869[M-H]－（陽離子模式），結合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）推斷其分子式為C44H70O17。13C-NMR和DEPT譜分析表明，該化合物44個碳信號中有27個碳信號屬于苷元部分。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）譜高場區中存在4個甲基氫信號δH1.02（s）、0.83（s）、1.15（d，J＝6.9 Hz） 和 0.71（d，J＝5.7 Hz），分別與13C-NMR譜中δC16.7、19.0、15.3和 17.3信號對應。化合物7的NMR譜中還存在2個季碳的信號（δC37.5，41.1）、1個半縮醛碳特征信號δC110.3和一組三取代烯烴信號[δH5.34（br d，J＝2.8 Hz）；δC141.5，129.1]。在HMBC中，H-6（δH5.26）與C-5（δC141.5）顯示遠程相關，表明存在雙鍵Δ5（6）。通過2D-NMR分析歸屬了化合物7的碳氫信號，與化合物4的苷元基本一致，區別在于化合物7的C-7為連氧叔碳，向低場位移，結合分子量推斷7位連接了1個羥基。通過H-7/H-8和H-7/H-15的NOE相關峰推斷7-OH為α構型。從而確定了化合物7的苷元結構。

將化合物7按照化合物1相同的方法水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析確定其單糖組成為D-葡萄糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖3種單糖（1∶1∶1）。13C-NMR譜中存在3個糖的端基碳信號δC100.3、102.7和109.5，與1H-NMR譜中的3個端基氫信號δH5.20（d、J＝7.8 Hz）、6.15（J＝1.7 Hz）和5.85（s）分別對應。通過HMBC譜確定了糖的連接方式：H-3（δC5.67）與GlcⅠC-1（δC100.3）存在遠程相關信號，說明GlcⅠ連接于苷元C-3位；RhaⅠH-1（δH6.15）與GlcⅠC-2（δC78.2）的遠程相關，以及Ara H-1（δH5.85）與GlcⅠC-4（δC77.8）的遠程相關表明RhaⅠ與Ara分別連接于GlcⅠ的2位和4位。通過與文獻[17]報道的化合物1的波譜數據對比，基本一致，從而確定物7的化學結構為（25R）-螺甾-5-烯-3β，7α-二醇-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

4 結果與討論

巴山重樓目前屬于近危植物[19]，一方面由于其較高的藥用價值，當地民眾對于其需求日益增加，另一方面，藥用重樓的需求量逐年上升，從植物形態學角度判斷，重樓屬植物種之間非常容易出現混種、替代以及質量不可控等問題，而巴山重樓可能出現種間替代，造成其資源急劇下降。出于保護基源物種和藥用資源可持續發展的目的，對其化學成分進行了研究，本文首次從中發現了7個皂苷類化合物。預實驗表明，巴山重樓含有種類豐富的皂苷成分，可能還存在一些新化合物，將進一步對其進行更深入的化學研究，以為其資源合理開發應用提供科學依據。