沉默環狀RNA hsa_circ_0076535表達對食管鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

楊瀟，胡龍淼

（1.上海市嘉定區安亭醫院 內科，上海 201800；2.國家肝癌科學中心 上海 201800）

食管癌（EC）是一種常見的癌癥類型，其致死率位于全球癌癥死亡的第6 位［1］。食管鱗狀細胞癌（ESCC）是一種由食管上皮細胞誘導的腫瘤，是EC 最常見的疾病亞型［2］。ESCC 具有極高的致死率，Ⅲ期ESCC 患者5 年內總生存率僅為10%～15%，Ⅳ期患者的中位生存期<1 年。ESCC 診斷和預后主要面臨該癥狀的晚期出現、內窺鏡檢查的成本或不適用、不敏感性及生物標志物的非特異性［1，3］。因此，迫切需要尋找用于ESCC 診斷、治療及預后、新的敏感且成本有效的生物標志物。

環狀RNA（circRNAs）正在成為非編碼RNA界的新星，是近些年研究癌癥診斷、治療及預后潛在分子靶點的熱門方向［4］。circRNAs 通過連接游離的3'-至5'-末端形成環狀結構，與mRNA 或線性非編碼RNA 相比，其具有更高的穩定性，且不含RNA 核酸外切酶［5］。circRNAs 不僅存在于細胞內，還可以輸出到細胞外發揮作用［6］。CricRNAs的這一特性使其可以通過進入到血液中作為檢測樣本的生物標志物，更重要的是circRNAs 被證實能夠在特定細胞類型或特定病理條件下表達［7］。此外越來越多的證據表明，circRNAs 被確認為癌癥的診斷或預后生物標志物，例如膠質瘤［8］和喉鱗狀細胞癌［9］等。然而關于circRNAs 在ESCC 中作為生物標志物的相關信息仍然需要繼續探索。有研究表明，circRNA hsa_circ_0076535 在ESCC腫瘤組織內表達升高，但是其對ESCC 細胞的影響仍舊未知［10］。本研究通過下調細胞內hsa_circ_0076535 的表達水平觀察其對ESCC 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，為尋找新型ESCC 腫瘤生物標志物及治療靶標奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

所有原發性ESCC 腫瘤組織及與之相匹配的正常組織均來自于2016 年1 月至2018 年12 月在上海市嘉定區安亭醫院接受手術的ESCC 患者，并通過經驗豐富的病理學家確認。所有患者術前均經食管鏡活檢病理學證實為ESCC，且術前未進行放化療。所有患者簽署書面知情同意書，且該研究得到了醫院癌癥倫理委員會的批準，所有程序都是按照相關指南進行。

1.2 方法

1.2.1 細胞株及主要試劑 人ESCC 細胞株Het-1A、Eca109、KYSE170 均來自于美國標準生物品收藏中心（ATCC）。RPMI 1640 細胞培養基購買于南京KeyGen 公司，胰蛋白酶及RIPA 細胞裂解液、RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、Platinum SYBR Super Mix 試劑及Lipofectamine 2000均購買于美國Invitrogen 公司，PCR 引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司。hsa_circ_0076535 干擾siRNA 片段由廣州銳博生物科技公司設計并合成。Matrigel 基質膠購自美國BD 公司，CCK-8 試劑盒購買于北京普洛麥格生物科技有限公司，Transwell小室（孔徑3.0 μm）購買于美國Corning 公司，免疫組織化學試劑盒及DAB 試劑盒均購自于美國R&D Systems。

1.2.2 RNA 提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）根據RNA 提取試劑盒說明書從組織及細胞樣本中提取總RNA 分子，然后按照反轉錄試劑盒說明書操作將RNA 反轉錄為cDNA，隨后進行PCR 反應對cDNA 進行擴增，以GAPDH作為內參。hsa_circ_0076535 及GAPDH PCR 引物序列如下，hsa_circ_0076535 正向引物：5'-GCGCCACTATGCCCAGCTAA-3'，反向引物：5'-GGCTGAGACGGGCAGATCAC-3'。GAPDH 正向引物：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物：5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3'。所有實驗均重復3 次。

1.2.3 細胞培養及轉染 將所有細胞在RPMI 1640培養基、37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養箱中進行細胞培養。通過Lipofectamine 2000 轉染試劑將hsa_circ_0076535 的siRNA 干擾片（si-circ）或對照基因片段（si-NC）轉染進KYSE170 細胞內，所有操作均按照轉染試劑說明書進行，轉染24 h 后進行下一步操作。

1.2.4 CCK-8 檢測細胞增殖能力 通過CCK-8 實驗檢測KYSE170 細胞增殖能力，所有步驟均按照試劑盒說明書進行。按照3000 細胞/孔將KYSE170 細胞種植于96 孔板內，分別在轉染后的0 h、24 h、48 h、72 h 及96 h 對細胞增殖能力進行檢測。在每個96 孔板的孔中均加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃孵育2 h，然后用酶標儀檢測450 nm 條件下溶液的吸光度值。每組實驗均重復3 次。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 取100個轉染后的KYSE170 細胞接種于6 孔板培養基上，在6 孔板中加入2 mL 含有10%胎牛血清的新鮮培養基。每3 天更換1 次培養基，14 d 后用4%多聚甲醛固定細胞并進行結晶紫染色，手動計算肉眼可見的克隆數目。

1.2.6 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 收集對數生長期的KYSE170 細胞，接種于6 孔板內，并在6 孔板的背面劃5 條平行線用作標記，48 h 后用10 μL 槍頭在細胞中劃2 條平行直線，與6 孔板背面的直線垂直。用0.01 M PBS 溶液輕輕漂洗細胞，然后加入2 mL 無胎牛血清的RPMI 1640 培養基，分別在0 h、48 h 將培養板置于倒置顯微鏡下觀察細胞向劃痕中間遷移的距離并拍照記錄，每組實驗設置3 個平行孔，且實驗重復3 次。

1.2.7 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 取轉染了si-circ 或si-NC 的對數生長期KYSE170 細胞種植于Transwell 小室的上室，下室中加入600 μL 含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養基。常規培養48 h 后，用棉簽輕輕擦凈上室中的細胞，用0.01 M PBS 溶液清洗后進行結晶紫染色，將Transwell 小室放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機觀察5 個視野，計算穿膜的細胞數。本實驗重復3 次。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hsa_circ_0076535 在ESCC 組織及細胞內高表達情況

分離ESCC 細胞系（Het-1A、Eca109、KYSE170）、ESCC 患者腫瘤組織及相應的癌旁組織內總RNA，通過qRT-PCR 對組織及細胞內hsa_circ_0076535 的表達水平進行檢測。實驗結果表明，與Het-1A 細胞相比，Eca109、KYSE170 細胞內hsa_circ_0076535 呈現高表達（見圖1A），且在ESCC 患者癌組織內同樣顯示高表達（見圖1B）（P<0.05）。hsa_circ_0076535 在ESCC 的發生過程中可能發揮著一定作用，然而這種作用目前并不明確。

圖1 hsa_circ_0076535 在ESCC 細胞系及組織內的表達水平

2.2 下調hsa_circ_0076535 能夠抑制ESCC 細胞增殖

設計并合成si-circ 干擾序列用于體外研究hsa_circ_0076535 對ESCC 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。將兩種si-circ（si-circ_1#、si-circ_2#）片段及si-NC 片段分別轉染進KYSE170 細胞內，轉染48 h 后通過qRT-PCR 對細胞內hsa_circ_0076535表達水平進行檢測。如圖2A 所示，檢測結果發現si-circ_1#具有較好的沉默效果，因此在接下來的實驗中選取si-circ_1#用于干擾目的基因的表達，隨后通過CCK-8 實驗對KYSE170 細胞的增殖活性進行檢測，分別在轉染后0 h、24 h、48 h、72 h 及96 h 時間點檢測細胞在450 nm 時的吸光度值，結果發現下調hsa_circ_0076535 的表達能夠抑制KYSE170 細胞增殖，且抑制效果隨時間的增加而增加（見圖2B）。此外，克隆形成實驗同樣證明下調細胞內hsa_circ_0076535 的表達水平能夠抑制細胞增殖（見圖2C）。總之，通過CCK-8 及克隆形成實驗證明下調ESCC 細胞內hsa_circ_0076535 的表達水平能夠抑制細胞增殖。

圖2 下調ESCC 細胞內hsa_circ_0076535 的表達水平對細胞增殖的影響

2.3 下調hsa_circ_0076535 能夠抑制ESCC 細胞遷移、侵襲

為了檢測hsa_circ_0076535 對ESCC 細胞遷移及侵襲能力的影響，在KYSE170 細胞中轉染了si-circ 或si-NC 核苷酸片段，通過劃痕愈合實驗及Transwell 實驗來驗證下調hsa_circ_0076535 對KYSE170 細胞的遷移及侵襲能力的影響。劃痕愈合實驗結果表明，細胞轉染48 h 后，轉染si-circ組細胞的遷移距離明顯小于轉染si-NC 組細胞及對照組細胞（P<0.05），下調hsa_circ_0076535 能夠顯著抑制KYSE170 細胞的遷移能力（見圖3A）。同樣的Transwell 實驗結果表明，轉染了si-circ 的KYSE170 細胞轉移至下室中的數目最少（見圖3B）。綜合上述實驗結果可知，下調ESCC 細胞中hsa_circ_0076535 表達水平能夠顯著抑制細胞的遷移及侵襲能力。

圖3 檢測hsa_circ_0076535 對ESCC 細胞遷移及侵襲能力影響的劃痕愈合實驗及Transwell 實驗

3 討論

circRNAs 首次發現于1976 年的植物中，并被證明能夠編碼亞病毒因子［11］。近些年隨著RNA-seq技術及生物信息學的發展，逐漸證明了circRNAs的豐度及多樣性，并在不同的發育階段和生理條件下揭示了circRNAs 的動態表達模式，且還發現了更多circRNAs 的功能，例如在蛋白質復合物的組裝中充當支架，調節親本基因的表達，充當miRNA 海綿［12-13］。

隨著研究的深入，逐漸積累的證據表明circRNAs 在許多疾病的發展過程中扮演著重要的角色［14-15］，由于其具有保守性、豐度及組織特異性的特點，使其可能在某些疾病分子中充當特殊的分子標志物，包括腫瘤［16-17］，例如研究報道環狀RNA hsa_circ_0014130 可能是潛在的非小細胞肺癌的臨床生物標志物［18］。癌癥是一種復雜的動態生物學過程，ESCC 也不例外，且多個基因被證明與ESCC 有關，例如lncRNA 中的NEAT1［19］、HOTAIR［20］等。然而目前還不清楚circRNA 是否與ESCC 相關。

本研究中證明了hsa_circ_0076535 在ESCC 組織及細胞系內高表達，這預示著hsa_circ_0076535可能與ESCC 存在一定的聯系。筆者利用siRNA技術干擾ESCC 細胞內hsa_circ_0076535 的表達水平，用于研究hsa_circ_0076535 與ESCC 細胞表型的關聯。CCK-8 實驗結果顯示，與轉染si-NC 組的細胞及對照組細胞相比，轉染si-circ 組ESCC 細胞增殖能力顯著下降，且隨時間的增加增殖能力降低更顯著。同樣的克隆形成實驗同樣證明，下調hsa_circ_0076535 在ESCC 細胞內的表達能夠顯著抑制細胞的增殖能力。此外劃痕實驗結果顯示，下調hsa_circ_0076535 的表達能夠顯著減小ESCC細胞的遷移距離及抑制細胞遷移。Transwell 實驗結果同樣顯示，抑制ESCC 細胞內hsa_circ_0076535 的表達能夠顯著降低轉移的細胞數目，顯著抑制ESCC 細胞的侵襲能力。

綜上所述，本研究結果證明，下調ESCC 細胞內hsa_circ_0076535 的表達水平能夠抑制細胞增殖、遷移及侵襲，且本研究首次在ESCC 中闡述了circRNAs 的作用，拓展了ESCC 的認識，并為尋找新的ESCC 潛在生物標志物奠定了基礎。