12個候選單核苷酸多態性位點與中國兒童急性淋巴細胞白血病易感性和預后的關系

王楨，吳蕊池，莫一嘯，陳靜，湯燕靜，沈樹紅，

1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童血液科，浙江 溫州 325027；2.上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心 血液腫瘤科，上海 200127

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童最常見的惡性腫瘤[1-3]，且發病率呈逐年上升趨勢。近年來基于危險度分層及危險度調整的個體化治療方案使得兒童ALL的治療取得了顯著改善，在發達國家，總生存率（overall survival rate，OS）達90%，長期無事件生存率（event-free survival rate，EFS）達80%[4]。上海兒童醫學中心（SCMC）一項研究顯示ALL患兒OS達80%，長期EFS達64.6%[5]，但仍有相當多的患兒在治療期間經歷復發、死亡、耐藥、第二腫瘤等。

ALL發病是多種環境和遺傳因素相互作用的結果[6]。近年來全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）表明，胚系單核苷酸多態性可能影響兒童ALL的易感性，有21個SNP位點和兒童ALL易感性相關[7-8]。有研究對部分位點進行了中國兒童ALL易感性驗證，發現位于ARID5B基因的rs10821936和rs10994982與ALL易感性相關[9-10]。前期本課題組根據上述基于歐美人群的兩個GWAS報道的兒童ALL易感性位點，結合NCBI數據庫亞洲人群中風險等位基因頻率，就其中12個SNP位點在191例ALL患兒與191例健康志愿者進行了驗證，發現ARID5B基因的rs10821936和rs10994982、ZNF230基因的rs7554607以及IKZF1基因的rs11978267和rs4132601為ALL潛在易感性位點，暫未發現國外GWAS報道的其他SNP位點與ALL發病的相關性[11]。因此，為了排除抽樣誤差，本課題組在前期研究的基礎上，擴大樣本量，增加365例病例對這12個SNP位點進行了基因分型，研究這些SNP位點與中國兒童ALL易感性的關系。

白血病療效是腫瘤細胞、藥物以及機體之間相互作用的結果。基于白血病細胞生物學特征的危險度分層（主要是遺傳變異分型）為白血病的精準治療奠定了基礎。近年來生殖系細胞的遺傳變異對ALL患兒預后影響越來越受到關注。已經發現抗白血病藥物的代謝酶GSTM1[12]、DHFR[13]以及轉運蛋白ABCC4[14]、ABCB1[15]和兒童ALL預后有關。此外，已經公認ALL細胞的IKZF1基因突變或缺失和預后相關，IKZF1胚系變異是否和兒童ALL預后有關同樣值得研究。

1 資料和方法

1.1 樣本量估計 根據前期研究結果，發現ARID5B基因的rs10821936位點CC基因型在病例組和對照組的頻率分別為0.237和0.112[11]。在α=0.05，1-β=0.08的水平按照病例對照研究樣本量計算最小樣本量為144例。

1.2 研究對象 包括2009年5月20日至2014年10月28日在SCMC診斷為ALL并嚴格按照SCMC-ALL-2005方案治療的365例患者，以及2008年至2017年在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院收治的191例ALL患兒和191例健康志愿者[11]，191例健康志愿者均為正常體檢的志愿者，無腫瘤疾病。病例均經骨髓涂片的形態學評估結合免疫表型分析、核型分析進行診斷。染色體易位，如：t（12；21）（ETV6-RUNX1），t（1；19）（TCF3-PBX1），t（9；22）（q34；q11）（BCR-ABL）和11q23/MLL重排使用反轉錄-聚合酶鏈反應或（和）熒光原位雜交確定。依據SCMCALL-2005化療方案危險度分級標準將患兒劃分為：低危（LR）、中危（IR）及高危（HR）。最終危險組是根據治療反應和微小殘留病（miuimell residual disease，MRD）水平確定的。MRD使用流式細胞術確定，靈敏度為0.01%。

1.3 隨訪 所有SCMC診斷的365例ALL患兒自出院之日起開始隨訪。OS定義為從確診至任何原因導致的死亡或末次隨訪時間。EFS定義為從確診至首個事件發生或末次隨訪時間。事件定義為復發、死亡、耐藥、放棄治療及第二腫瘤。復發定義為完全緩解后出現骨髓復發（骨髓原始+幼稚細胞大于25%）和（或）髓外復發包括中樞神經系統復發（出現相應的癥狀和體征以及腦脊液中白血病細胞≥5×106/L） 和睪丸復發（病理活檢證實有白血病細胞浸潤）。放棄治療被定義為未能完成治愈性治療。失訪定義為完成治愈性治療后失去聯系。隨訪終點為2019年12 月，隨訪時間為6.8（0.09～10.51）年。

1.4 靶向多重PCR擴增子的文庫構建與二代測序

1.4.1 文庫構建：365例患兒緩解期骨髓凍存細胞采用德國Qiagen公司的QIAamp?DNA Blood Mini Kit（cat. no.51104）抽提基因組DNA，-20 ℃冰箱保存。取1 μL所提基因組DNA，采用美國Thermo Fisher公司的Qubit?dsDNA HS Assay Kits（cat. no.Q32854）通過Qubit?3.0熒光儀測定基因組DNA濃度。采用iGeneTech?研發的MultipSeq?CustomPanel（IGMU160V1）試劑盒通過兩步PCR擴增方法來完成目標區域擴增和建庫。

1.4.2 二代測序和生物信息分析：使用上述試劑盒構建出的合格文庫，在美國Illumina公司的NextSeq 6000測序儀上進行測序。原始測序數據使用Burrows-Wheeler Aligner軟件（BWA v 0.7. 17-r1188）與人類基因組參考序列（hg19）進行比對[16]，然后用samtools軟件[17]對比對結果做單核苷酸多態性位點檢測分析（篩選條件：比對質量＞20，同時測序深度＞500），用ANNOVAR軟件[18]對檢測出的多態性位點進行功能注釋。

1.5 統計學處理方法 采用SPSS23.0軟件進行分析。計數資料用率及百分比表示，病例組和對照組基因型分布和等位基因頻率的差異比較采用χ2檢驗；Logistic回歸分析所選SNP與ALL風險的相關性；OS、EFS及累積復發率采用Kaplan-Meier分析方法進行評估，組間差異用Log-rank檢驗進行分析；預后因素的影響采用單因素和多因素Cox回歸模型分析；所有統計分析均為雙側檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒臨床特征 納入研究的556例患兒的臨床特征見表1。

表1 ALL患兒臨床特征（n=556）

2.2 隨訪結果 截至隨訪終點時間2019年12月，在365例患兒中，中位隨訪時間為6.8（0.1～10.5）年。其中62例（17.0%）患兒復發，25例（6.8%）患兒死亡，15例（4.1%）患兒放棄治療，4例（1.1%）患兒失訪，3例（0.8%）患兒轉院。

2.3 12個SNP位點與兒童ALL易感性的關系 對對照組進行H-W平衡檢檢，觀察到所有基因型都符合H-W平衡[11]。病例組和對照組中SNP的基因型分布和等位基因頻率及其與兒童ALL易感性的關系見表2-3。Logistic回歸分析顯示ARID5B基因的rs10821936位點CC基因型、風險等位基因C與ALL風險增加顯著相關（P＜0.05）；rs10994982位點AG基因型、AA基因型、風險等位基因A與ALL風險增加顯著相關（P＜0.05）；位于IKZF1基因的rs11978267位點GA基因型、風險等位基因G與ALL風險增加顯著相關（P＜0.05）；rs4132601位點GT基因型、風險等位基因G與ALL風險增加顯著相關（P＜0.05）；位于ZNF230基因的rs2191566位點CC基因型、風險等位基因C與ALL風險增加顯著相關（P＜0.05）。

表2 12個SNP位點與ALL易感性的關系（n=556）

續表2

2.4 12個SNP位點與兒童ALL預后的關系 在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院收治的191例ALL患兒因病例資料收集不完善未納入該部分分析，所以該部分分析僅包含在SCMC診斷為ALL的365例患兒。通過Kaplan-Meier方法進行生存分析發現，LOC102723724基因的rs11155133位點AA、AG、GG基因型OS、EFS及累積復發率差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；SIAT7C基因的rs10873876位點CC、TC、TT基因型EFS及累積復發率差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1-2。單因素及多因素Cox回歸分析顯示，LOC102723724基因的rs11155133位點GG基因型及SIAT7C基因的rs10873876位點TC基因型是EFS的不良預后因素（P＜0.05），同時也是累積復發率的不良預后因素（P＜0.05）。見表4-5。

表4 EFS的單因素和多因素Cox回歸分析（n=365）

圖1 LOC102723724基因的rs11155133位點AA、AG、GG基因型的生存曲線圖（n=365）

圖2 SIAT7C基因的rs10873876位點CC、TC、TT基因型的生存曲線圖（n=365）

3 討論

ALL在兒童和青少年中的癌癥發病率最高，其病因在很大程度上仍未知[19]。通過對人類基因組的分析，確定了與ALL易感性有關的21個SNP位 點[7-8]。本課題組在前期研究基礎上擴大樣本量，對歐美人群易感性相關的12個SNPs位點進行驗證，發現ARID5B基因的rs10821936和rs10994982以及ZNF230基因的rs7554607多態性位點與我國ALL易感性相關，IKZF1基因的rs11978267和rs4132601多態性位點可能與中國ALL易感性相關，與前期研究結果一致[11]。在單純擴大病例組后，與前期研究結果比較，我們發現與ALL易感性相關及不相關的位點在中國兒童人群中未發生任何變化，說明SNP位點確實具有人群特異性。

在易感性研究中值得一提的是IKZF1基因。早在2009年PAPAEMMANUIL等[7]及TREVI?O等[8]分別報道了IKZF1基因的rs11978267和rs4132601位點與ALL易感性相關。WANG等[9]對rs4132601位點在中國兒童ALL與健康人群中進行了驗證，未發現與中國人群兒童ALL易感性相關。我們的研究發現IKZF1基因的rs11978267和rs4132601這兩個位點的雜合基因型及風險等位基因與ALL風險增加顯著相關，但風險等位基因的純合基因型因病例數少未觀察到與ALL風險增加有關[11]。進一步分析rs4132601位點基因型TT、GT、GG及風險等位基因G頻率在 PAPAEMMANUIL等[7]、WANG等[9]及我們的病例-對照研究中分布情況，發現與歐美人群相比，中國人群G等位基因攜帶者（GT、GG）及風險等位基因G頻率明顯降低，進一步表明SNP位點確實具有人群特異性。隨后我們將WANG等[9]的研究數據和我們的合并，發現rs4132601位點GT基因型、GG基因型、風險等位基因G與ALL風險增加顯著相關（見表3），表明擴大樣本后，證實該位點的確與中國兒童ALL易感性相關。而rs11978267位點由于缺乏在中國兒童ALL的研究數據，不能進一步確定該位點與ALL易感性的關系，后期可擴大樣本量進行驗證。

表3 rs4132601位點與ALL易感性的關系（n=1 124）

近年來，兒童ALL的療效有了很大提高，大部分患兒可以用化療治愈。SCMC-ALL-2005研究是我國最早基于MRD監測進行危險度分層治療的多中心臨床研究隊列。該研究歷時10年，共入組治療1 085例初診ALL病例，獲得5年EFS（68.3±1.4）%、OS（80.0±1.2）%的療效。在這個研究中充分體現了危險度分層治療的優勢，也體現了MRD對與危險度分層的重要性。該研究的單因素分析中35 d MRD對預后的影響非常顯著。但是，將危險度分層也作為多變量之一進行多因素分析時，35 d MRD不再是影響預后的獨立危險因素。同樣年齡大于10歲、診斷時白細胞計數＞50×109/L以及T-ALL也同樣不再是影響預后的獨立危險因素。這可能是因為危險度分層已經包涵了影響預后的診斷生物學特征以及基于MRD的治療反應信息，更能體現預后的預測價值。此外，根據危險度分層進行調整的治療強度也改變了具有包括MRD陽性等危險因素的患者的最終預后[5]。本研究大部分樣本來自SCMCALL-2005研究隊列后5年的病例，其中這個隊列的臨床記錄完整，所以也只對這些病例進行了預后分析。同樣這部分患者的35 d MRD在單因素分析時可見非常顯著的預后影響，但在多因素分析中未能顯示顯著性。本研究對兒童ALL易感性相關的12個SNP位點與疾病預后進行的相關分析發現，無論是單因素分析還是和危險度分層等預后相關因素一起進行多因素分析，SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133多態性位點均與ALL預后顯著相關，表明這些遺傳因素是獨立于現行ALL風險分層模型以外的獨立危險因素。這再次證實化療對腫瘤細胞的殺傷作用，不僅取決于腫瘤細胞自身的遺傳特征，還取決于宿主固有的遺傳特征[20]。目前，根據分子標志物調整治療強度是提高ALL治愈率的主要策略之一[4]。但是，由于研究數據相對缺乏，宿主的胚系遺傳特征通常不用于ALL患者危險度分層或治療強度的調整。候選基因研究表明，遺傳多態性影響白血病治療結果[12，14]。 也有研究表明與ALL易感性相關的SNP也與ALL預后相關[21]。如XU等[21]在2012年首次提出與ALL易感性相關的SNP也與ALL預后相關，該研究中發現ARID5B基因的rs10821936和rs10994982位點與ALL易感性相關但與預后無關。MOSAAD等[22]研究發現ARID5Brs10821936和rs10994982基因型之間的OS和DFS沒有顯著差異。MULLIGHAN等[23]研究表明IKZF1可以作為兒童ALL的腫瘤抑制因子，其丟失與預后不良有關。2017年BIELSKA等[24]報道IKZF1rs4132601基因多態性影響彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）的治療結果。2020年MOSAAD等[19]研究IKZF1rs4132601和rs11978267基因多態性與ALL預后的關系發現rs4132601 GG基因型是成人ALL預后不良的危險因素但與兒童ALL預后無關。本研究提示SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133多態性位點與預后顯著相關，可作為指導患兒危險度分層的生物學標志物，選擇合適的化療方案，提高預后。

表5 累積復發率的單因素和多因素Cox回歸分析（n=365）

SIAT7C屬于唾液酸轉移酶家族，越來越多的研究表明，異常唾液酸化與惡性腫瘤的表型密切相關，包括增殖、侵襲、轉移和耐藥性[25-26]。最近一項研究表明，唾液酸化和唾液酸轉移酶可能是急性T淋巴細胞白血病多藥耐藥的潛在生物標志物[27]。SIAT7Crs10873876多態性位點位于基因的內含子上，內含子可能通過調節轉錄速率或通過影響轉錄產物的長度來調節基因表達。因此，我們推測SIAT7Crs10873876 TC基因型影響ALL預后可能與抗白血病藥物耐藥有關。LOC102723724是一個RNA基因，屬于長非編碼RNA（lncRNAs），研究表明， lncRNAs轉錄物作為潛在的診斷和（或）預后生物標志物出現在不同的人類疾病中，包括惡性血液病[28-29]。 有研究提出lncRNAs與ALL生存率差和復發趨勢增加有關[30-31]。因此，可能解釋LOC102723724rs11155133 GG基因型影響ALL預后的原因。

綜上所述，ARID5B基因的rs10821936和rs10994982、ZNF230基因的rs7554607以及IKZF1基因的rs11978267和rs4132601為中國兒童ALL潛在易感性位點。本研究在中國兒童中報道SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133這兩個白血病易感性相關位點與兒童ALL預后相關，為白血病的診斷、治療及預防工作提供了一定的幫助，有必要針對以上SNP位點開展進一步臨床試驗研究。