腺苷-3’, 5’-環(huán)磷酸-氧蒽酮希夫堿的合成及其與LC3B的綁定結(jié)合

周超群，湯石鵬，錢(qián)亮亮，甄政安，程如梅

溫州醫(yī)科大學(xué) 眼視光學(xué)院（生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院） 納米生物材料研究所，浙江 溫州 325027

正確的蛋白折疊形態(tài)是維持細(xì)胞與組織穩(wěn)定生化過(guò)程的基礎(chǔ)[1]。基因突變、應(yīng)激以及不良的翻譯后修飾常常導(dǎo)致蛋白錯(cuò)誤折疊[2]。錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積易引發(fā)一系列疾病，例如阿爾茨海默病、亨廷頓病、白內(nèi)障等[3]。最近，科學(xué)家嘗試?yán)米允蓸?biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）作為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)引導(dǎo)型藥物分子，識(shí)別并誘導(dǎo)致病的錯(cuò)誤折疊蛋白定位到自噬體膜上，利用自噬降解相關(guān)致病蛋白，保留結(jié)構(gòu)相近的功能性蛋白，達(dá)到治療目的，取得了理想的結(jié)果[4]。

本研究將氧蒽酮與腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸反應(yīng)，得到腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸-氧蒽酮希夫堿（S1），研究其與自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的作用，得到二者的結(jié)合模式和穩(wěn)定常數(shù)，從分子水平上揭示如何通過(guò)LC3B的作用來(lái)開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)自噬的潛在藥物。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 氧蒽酮、腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸、三乙胺、磷酸系PBS緩沖溶液、乙醇，均由國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司提供。重組人LC3B蛋白（ab103506）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。LC3B溶液使用時(shí)新鮮配制。所有溶液均用去離子水配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Lamda 35，美國(guó)Perkin Elmer公司），熒光光譜儀（AB-series 2 luminescence spectrometer，日本Hitachi High-Technologies公司），元素分析儀（Vario EL III型，德國(guó)Elmentar公司）。

1.3 S1的合成 將0.1961 g（1 mmol）氧蒽酮溶解于20 mL無(wú)水乙醇中，加入0.3292 g（1 mmol）腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸和0.3 mL冰醋酸，加熱回流450 min，冷到室溫，過(guò)濾，收集淺黃色沉淀，分別用水、乙醇、無(wú)水乙醚洗滌多次。真空干燥。產(chǎn)率：73%。元素分析：計(jì)算值C22H18N5O7P，C 53.34%，H 3.66%，N 14.14%，O 22.61%；測(cè)試值：C 53.32%，H 3.86%，N 14.11%，O 22.63%。

1.4 光譜測(cè)試 所有測(cè)試均在pH 7.4的PBS緩沖溶液中進(jìn)行，使用時(shí)將LC3B新鮮配成濃度為1× 10-4mol/L工作溶液；測(cè)試前將LC3B溶液和S1溶液混合后放置160 s，再進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜或者熒光光譜測(cè)定。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定，將LC3B溶液和S1溶液調(diào)成所需要的濃度，混合后，間隔一定時(shí)間測(cè)定 352 nm附近的紫外-可見(jiàn)光譜變化。

2 結(jié)果

2.1 LC3B與S1作用的動(dòng)力學(xué) 圖1為濃度 2.0×10-5mol/L的S1與LC3B作用160 s后的紫外-可見(jiàn)光譜圖。由圖1可見(jiàn)，S1有三個(gè)典型的譜峰，分別在239、260、341 nm處。位于大約270 nm處的一個(gè)弱而寬的峰，歸屬于LC3B芳基氨基酸殘基的弱的n-π*吸收峰。將濃度相同的S1和LC3B溶液混合，每隔一段時(shí)間對(duì)體系進(jìn)行掃描，所得的紫外-可見(jiàn)光譜圖見(jiàn)圖2。從圖可知，在剛開(kāi)始時(shí)S1的紫外-可見(jiàn)光譜處于最上端，加入LC3B后吸光度下降。在160 s之內(nèi)，隨時(shí)間的推移，光譜逐步從341 nm紅移，最后穩(wěn)定在350 nm，吸收強(qiáng)度緩慢下降。

圖1 S1和LC3B相互作用的紫外-可見(jiàn)光譜圖

圖2 S1和LC3B隨時(shí)間變化的紫外-可見(jiàn)光譜圖（S1和LC3B濃度均為1.0× 10-5 mol/L）

由一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程和朗伯比爾定律[5]，得

式中A0、A分別為S1全部處于自由狀態(tài)下的吸光度和S1與LC3B完全結(jié)合后的吸光度（這里取波長(zhǎng)為352 nm處的吸光度），At為時(shí)刻t時(shí)的吸光度，k是反應(yīng)速率常數(shù)。通過(guò)ln(A-A0)對(duì)t作圖，可以得到S1與LC3B結(jié)合后的反應(yīng)速率常數(shù)（見(jiàn)圖3、表1）。

表1 LC3B與S1不同比例的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖3 不同[LC3B]/[S1]比例的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)關(guān)系圖

2.2 LC3B與S1作用的熱力學(xué)研究 圖4顯示在239 nm 激發(fā)下，LC3B在278 nm處有一個(gè)很寬的熒光峰，而S1在315 nm發(fā)出較強(qiáng)的熒光，覆蓋了大部分的LC3B譜峰。S1熒光峰隨著LC3B濃度變化（見(jiàn)圖5）的測(cè)定結(jié)果表明隨著LC3B濃度的增大，S1在315 nm處的熒光峰并沒(méi)有成比例提高，反而呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

圖4 S1和LC3B溶液的熒光光譜

圖5 LC3B對(duì)S1的熒光滴定圖

從分子相互碰撞能量轉(zhuǎn)移的角度研究，當(dāng)熒光體與猝滅劑由于熱運(yùn)動(dòng)發(fā)生碰撞時(shí)，可引起熒光體的熒光猝滅。這種碰撞猝滅服從Stern-Volmer方 程[6]：

其中F0是自由的S1的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)是加入LC3B后的熒光強(qiáng)度，C為L(zhǎng)C3B的濃度，Ksv為Stern-Volmer熒光猝滅常數(shù)。從圖6和表2看，S1和LC3B作用符合Stern-Volmer方程。在這樣的情況下，碰撞分子形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)K和位點(diǎn)數(shù)n與熒光強(qiáng)度存在以下關(guān)系：

圖6 不同溫度下的Stern-Volmer線性圖

綜合Stern-Volmer方程關(guān)系，得到表2的Stern-Volmer方程和分子復(fù)合物參數(shù)。

表2 LC3B滴定S1的熒光特征參數(shù)

由表2所得到的S1和LC3B結(jié)合常數(shù)K可以進(jìn)一步計(jì)算出S1和LC3B結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG：

式中ΔG、ΔH、ΔS分別為吉布斯自由能、焓變及熵變。其結(jié)果列于表3。

表3 S1結(jié)合到LC3B上的熱力學(xué)參數(shù)

3 討論

藥物分子與蛋白質(zhì)分子的相互作用包括靜電力、氫鍵、疏水作用力和范德華力。不同類(lèi)別的作用力將會(huì)影響藥物分子與蛋白質(zhì)結(jié)合、藥物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程。為此，本研究從分子動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)角度去探討與自噬相關(guān)的LC3B靶向化合物的作用模式。由圖1紫外-可見(jiàn)光譜可知，S1在239和260 nm處顯示出兩處典型的共軛環(huán)π-π*躍遷峰，290 nm的寬的肩峰為雜環(huán)的n-π*吸收峰，而希夫堿的C=N強(qiáng)烈的n-π*則出現(xiàn)在341 nm處。LC3B只顯示很弱的芳基氨基酸殘基的n-π*吸收峰。通過(guò)時(shí)間變化觀察LC3B與S1的變化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加S1的C=N吸收峰下降，并逐步紅移，最后平衡在352 nm。說(shuō)明S1與LC3B作用有一個(gè)緩慢的滯后期，時(shí)間為 4 min，希夫堿就與LC3B發(fā)生了強(qiáng)烈的作用。且當(dāng)S1作用于LC3B時(shí)，LC3B在反映蛋白質(zhì)螺旋結(jié)構(gòu)的210 nm處吸光度有所下降，顯示出S1有嵌插進(jìn)入LC3B主鏈的情況，螺旋結(jié)構(gòu)稍微變松散[7]。改變S1和LC3B濃度比，可以發(fā)現(xiàn)所得的反應(yīng)速率常數(shù)基 本維持不變，符合準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)和藥物的定比轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律[8]。

熒光光譜表明隨著LC3B的加入，S1位于315 nm的熒光發(fā)射峰緩慢下降，而該峰與S1分子中的C=N雙鍵和幾乎共平面的氧蒽酮三環(huán)共軛結(jié)構(gòu)相關(guān)[9]， 表明S1和LC3B的相互作用的確發(fā)生在希夫堿的碳氮雙鍵上，與紫外-可見(jiàn)光譜的結(jié)果一致。S1和LC3B作用符合Stern-Volmer方程，隨著溫度的升高，斜率下降，表明溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，并沒(méi)有引起熒光猝滅的增強(qiáng)，體系不是動(dòng)態(tài)猝滅，為靜態(tài)猝滅，二者形成了復(fù)合物。且在不同實(shí)驗(yàn)溫度下，Stern-Volmer方程具有良好的線性關(guān)系，說(shuō)明復(fù)合物只有一種結(jié)合模式。通過(guò)方程（3）計(jì)算得到S1和LC3B的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1。熱力學(xué)結(jié)果表明，吉布斯自由能ΔG＜0，S1和LC3B的結(jié)合為一個(gè)自發(fā)的過(guò)程。而研究[10]表明，當(dāng)ΔH＜0、ΔS＞0，藥物分子與蛋白質(zhì)之間主要是疏水作用，當(dāng)ΔH＜0、ΔS＜0時(shí)為典型的氫鍵和范德華力結(jié)合，而當(dāng)ΔH接近0、ΔS＞0或者當(dāng)ΔH＜0，忽略ΔS的情況下，主要為靜電作用。結(jié)合前述光譜研究和表3，可以發(fā)現(xiàn)S1和LC3B的作用力主要為靜電作用，這種靜電力，影響了C=N上的電子共軛，從而導(dǎo)致熒光猝滅。

綜上所述，本研究合成得到了一種具有LC3B結(jié)合綁定功能的腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸-氧蒽酮希夫堿，其與LC3B的結(jié)合滿(mǎn)足準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和藥物分子的定比轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律。分子熱力學(xué)研究表明二者的結(jié)合為靜電作用的結(jié)果，S1與LC3B以一種復(fù)合物的結(jié)合模式存在，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1。