選擇性頭部亞低溫對缺氧缺血性腦病新生兒血清細胞焦亡相關分子的影響

詹 震，林先紅，鄭 洪，張詩海，解啟蓮

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是指圍生期窒息、缺氧、缺血引發的新生兒腦損傷性疾病。在發達國家新生兒HIE的發生率為活產兒的1‰～8‰，在欠發達國家這一數字高達26‰[1]。HIE病情進展可導致不同程度的神經系統后遺癥，是兒童神經系統損傷如智力障礙、癲癇、腦性癱瘓等的常見原因之一。歷史上對于HIE急性期治療主要以全身支持和對癥治療為主，近年來醫學研究致力于尋找治療HIE新途徑。亞低溫療法通過物理方法將體溫下降2～5 ℃而達到疾病治療目的。研究[2]顯示，亞低溫療法可降低HIE新生兒的病死率和18月齡時嚴重殘疾的發生率，對于中、重度HIE新生兒，適度的亞低溫治療現已成為標準治療方案的一部分。

細胞焦亡是一種新發現的促炎性細胞程序性死亡方式，廣泛參與許多神經系統相關疾病的發生、發展，如腦損傷、癲癇、中樞神經系統感染、神經退行性疾病等，亦被發現在HIE病理生理中起著至關重要的作用。細胞焦亡的經典途徑依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)的激活，并伴隨釋放大量炎性細胞因子如白細胞介素(IL)-1β、IL-18，產生促炎信號，從而誘發強烈的炎性反應[3]。亞低溫具有明確的神經細胞保護作用，我國選擇性頭部亞低溫治療新生兒缺氧缺血性腦病多中心協作組[4]證實，選擇性頭部亞低溫(selective head cooling，SHC)治療可降低HIE新生兒嚴重傷殘率。本研究選取細胞焦亡特征性的炎性關鍵酶Caspase-1以及細胞因子IL-1β、IL-18三項指標，觀察SHC治療不同臨床分期HIE新生兒上述三項指標的變化，以期了解SHC治療HIE可能的神經保護機制。現作報道。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018年8月至2020年7月我院新生兒科病區收治的確診為HIE的新生兒共45例(HIE組)。其中男21例，女24例；出生體質量2.50～4.33 kg；出生胎齡37.9～38.7周；輕度HIE 13例，中度HIE 20例，重度HIE 12例。中、重度HIE新生兒共32例按照是否進行SHC治療分為常規治療組(常規組)15例和SHC治療組(SHC組)17例，常規組男7例，女8例，出生體質量3.09～3.55 kg，出生胎齡37.9～38.4周；SHC組男7例，女10例，出生體質量2.88～3.52 kg，出生胎齡38.0～38.3周。同期選取正常足月新生兒10名作為對照組，男5名，女5名，出生體質量2.50～3.96 kg，出生胎齡37.6～39.0周。各組新生兒性別、出生體質量、出生胎齡均具有可比性。本研究經醫院醫學研究倫理委員會審核及批準。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 HIE組 納入標準：符合2005年8月中華醫學會兒科學分會新生兒學組制定的《新生兒缺氧缺血性腦病診斷標準》[5]，并按照該標準中臨床分度標準確定HIE患兒臨床分期。排除標準：新生兒母親孕期有妊娠合并癥如高血壓、乙型肝炎、糖尿病、傳染病等。

1.2.2 SHC組 納入標準：診斷為中、重度HIE，出生胎齡≥36周，且出生體質量≥2 500 g的新生兒，同時具有以下情況，(1)存在胎兒宮內窘迫的依據；(2)存在新生兒窒息的依據；(3)存在新生兒HIE或者振幅整合腦電圖腦功能檢測異常的依據。排除標準：(1)出生時間>12 h；(2)初始振幅整合腦電圖檢查無異常；(3)具有復雜難治性先天性畸形；(4)存在自發性出血傾向；(5)存在急性顱腦損傷相關疾??；(6)存在先天性感染相關疾病。

1.2.3 對照組 納入標準：新生兒母親孕期均無妊娠合并癥，新生兒無宮內生長發育遲緩史，出生時無窒息史。

1.3 方法 HIE組新生兒確定臨床分期及治療方案后積極予以治療，此過程在新生兒出生12 h內完成，常規組予對癥支持治療，即積極三維持(維持良好的通氣、換氣功能；維持周身和各臟器足夠的血液灌流；維持血糖在正常高值)，三對癥治療(控制驚厥、降低顱內壓、消除腦干癥狀)。SHC組在積極常規治療基礎上進行SHC治療，操作過程按照復旦大學附屬兒科醫院新生兒腦損傷課題組[6]制定的《亞低溫治療新生兒缺氧缺血性腦病方案(2011)》實行。

1.4 觀察指標 比較各組新生兒治療前后不同時點血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平。以確定HIE組新生兒臨床分期與治療方案開始治療為0 h，分別采集對照組、HIE組新生兒外周靜脈血2 mL，并于治療24、48、72 h分別采集SHC組、常規組新生兒外周靜脈血2 mL，均置于采血管中，3 500 r/min離心后分離血清，于-15 ℃冷凍保存。采用ELISA法測定血清標本中Caspase-1、IL-1β、IL-18水平，試劑盒由Solarbio公司提供，操作方法嚴格按照說明書進行。

1.5 統計學方法 采用t檢驗、方差分析、q檢驗和Spearman相關分析。

2 結果

2.1 對照組和不同分期HIE組新生兒血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平比較 不同臨床分期HIE組新生兒血清Caspase-1、IL-1β水平均高于對照組，且Caspase-1、IL-1β水平均隨HIE臨床分期加重而上升(P<0.05)；重度、中度HIE組血清IL-18水平均高于對照組和輕度HIE組，重度HIE組亦高于中度HIE組(P<0.05)，但輕度HIE組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平與HIE臨床分期相關性分析 HIE新生兒血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平與HIE臨床分期均呈明顯正相關關系(rs=0.820、0.913、0.683，P<0.01)。

2.3 SHC組和常規組治療前后血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平比較 2組0 h血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平差異均無統計學意義(P>0.05)，SHC組治療24 h血清Caspase-1和48、72 h時血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平均明顯低于常規組(P<0.01)。治療48、72 h，SHC組Caspase-1、IL-1β、IL-18水平均明顯低于0、24 h(P<0.05)；而常規組48 h時血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平均較0 h上升(P<0.05)，72 h時IL-1β、IL-18水平仍明顯高于0 h，而Caspase-1水平與0 h差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 SHC組和常規組各時點血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平比較

3 討論

新生兒HIE腦損傷發生機制有許多因素參與，如線粒體損傷、自由基的產生、氧化亞氮合酶的活化、炎癥反應、細胞凋亡等[7]。HIE最突出的特征是神經元的死亡引起嚴重的炎癥反應，這種炎癥反應主要由小膠質細胞介導，小膠質細胞是中樞神經系統唯一的先天免疫細胞，小膠質細胞在各種信號刺激下，NLRP3等相關蛋白形成炎性小體并發展成活化的Caspase-1，Cpaspase-1會切割IL-1β、IL-18原蛋白并激活GSDMD打孔蛋白，釋放出大量IL-1β、IL-18并誘導細胞膜穿孔，從而觸發細胞焦亡經典途徑[8]。研究[9]顯示，HIE患兒外周血細胞焦亡經典途徑的關鍵分子水平的升高與損傷的嚴重程度密切相關，并通過建立缺血缺氧腦損傷體外模型進一步證實NLRP-3/Caspase-1/GSDMD軸介導的經典細胞焦亡途徑參與了HIE的病理生理機制，導致更高水平的小膠質細胞活化。

亞低溫治療HIE的神經保護機制與溫度與代謝之間的關鍵關系有關，同時可減少新生兒缺氧缺血再灌注后引起的神經元細胞凋亡以及抑制炎癥反應[10]。細胞凋亡已被證實是HIE腦損傷中遲發性級聯性神經細胞死亡的方式之一[11]，不同于細胞凋亡，細胞焦亡需炎性Caspase介導且具有強烈的促炎性特征，是一種新發現的HIE腦損傷發生機制，目前對于亞低溫治療HIE的神經保護機制尚未完全清楚，為揭示亞低溫治療HIE的可能保護機制，我們假定SHC治療HIE可通過減少細胞焦亡水平來實現神經保護作用，開展本次研究。

細胞焦亡經典途徑依賴于Caspase-1的介導，其具有通過蛋白水解的切割方式作用于大多數底物的裂解，包括炎性體相關的細胞因子IL-1β、IL-18及細胞焦亡的最終執行蛋白GSDMD[12]。XU等[13]利用Caspase-1抑制劑VX765處理CLP誘導的膿毒癥小鼠模型，發現抑制劑顯著下調了細胞焦亡水平并減少了炎癥細胞因子的釋放，保護了腦的超微結構。Caspase-1是細胞焦亡經典途徑必不可少的關鍵蛋白。本研究結果顯示，不同程度HIE組新生兒血清Caspase-1水平均高于對照組，且其水平隨病情嚴重而增加；接受常規治療的中、重度HIE新生兒血清Caspase-1濃度水平在48 h前隨治療時間的推移上升，而后緩慢下降，接受SHC治療的新生兒Caspase-1濃度水平隨治療時間的推移呈逐漸下降趨勢，未見高峰。提示Caspase-1與HIE病情發生發展密切相關，且與常規治療比較，SHC治療可有效降低Caspase-1水平，SHC可能通過類似Caspase-1抑制劑的神經保護機制減少HIE病程中細胞焦亡水平以改善病程。

IL-1β、IL-18是在天然免疫防御過程中細胞焦亡經Caspase-1充分切割底物釋放的主要細胞炎癥因子。研究[14]表明，細胞焦亡最終導致細胞膜破裂的重要執行蛋白GSDMD影響著IL-1β的分泌過程。本研究發現，HIE新生兒血清IL-1β、IL-18與Caspase-1水平同時隨病情嚴重程度升高，這或說明它們之間可能存在上下游作用的關系，相關分析結果顯示，Caspase-1、IL-1β、IL-18與HIE臨床分期具有相關關系。HUANG等[15]利用IRE1α抑制劑STF083010作用于新生HIE大鼠模型，導致了IL-1β、IL-18表達降低，證明抑制劑在新生HIE大鼠模型中通過逆轉HIE細胞焦亡的神經保護機制。本研究結果顯示，HIE新生兒血清IL-1β、IL-18水平均高于對照組，且隨病情嚴重程度而升高；常規組IL-1β、IL-18水平治療后呈上升趨勢，而SHC組IL-1β、IL-18水平治療后各時點均呈下降趨勢。提示IL-1β、IL-18在HIE病情發生、發展中發揮誘發炎癥反應的作用，SHC治療HIE可通過類似IRE1α抑制劑減少細胞焦亡水平而抑制缺氧缺血后炎癥反應的機制發揮作用。

綜上，細胞焦亡可能在HIE發生、發展中起重要作用，而SHC治療可能通過減少缺氧缺血性腦損傷后的細胞焦亡水平而達到神經保護作用，由此可為新的HIE亞低溫治療方案設計及神經保護藥物開發提供思路。