HIF-1α及其相關通路在缺氧缺血性腦病中的研究進展

李健維，謝宗玉

新生兒腦損傷(neonatal brain injury，NBI)可由多種因素導致，例如缺氧缺血(hypoxic-ischemic，HI)、宮內感染以及圍產期出血等[1]。缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是由圍產期新生兒腦部HI導致復雜的生理、細胞和分子變化的一類最常見NBI，在發達國家中發病率約為1.5%，而中低收入國家則高達1%～2%[2]。一旦新生兒發育大腦發生HI后，大量的未成熟神經細胞對缺氧高度敏感，大面積腦區的神經元會死亡，患兒急性死亡或者多種慢性終身疾病風險顯著提高，例如視力障礙、學習障礙、癲癇、智力低下、失明或者腦癱等并發癥。因此，探討HIE發病的分子機制，從分子機制角度探討臨床上安全有效的治療方案是當前國內外治療HIE的熱點。

缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是機體面臨HI時的重要應激信號。1992年，SEMENZA[3]首次證明HIF-1是與低氧反應因子(hypoxia response element，HRE)結合的轉錄因子，增加了促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)的表達。目前發現的受HIF-1調控的基因約70余種，例如EPO、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitrogen oxide synthase，iNOS)、葡萄糖轉運蛋白-1(glucose transporter 1，GLUT-1)、胰島素樣生長因子-2(insulin like growth factor-2，IGF-2)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，主要涉及紅細胞生成、血管發生、能量代謝、細胞凋亡和增殖等多個HIE相關過程[4]。因此，HIF-1及其相關通路參與哺乳動物缺氧性特異應答的基因表達調控，使機體對HI產生適應反應，在HIE的發病和進展發揮重要作用。目前臨床上治療HIE的方法較多，在常規的對癥支持治療基礎上會結合活性氧自由基清除劑、凋亡抑制類藥物、iNOS抑制類藥物、鈣通道阻滯劑、神經生長因子、腦細胞代謝激活劑或者亞低溫及高壓氧等方案[5]。本文介紹HIF-1α及其相關信號通路在HIE中的分子機制，并對可能的臨床治療策略進行探討。

1 HIF-1通路的分子基礎和活性調控

HIF家族主要存在三種形式，包括HIF-1、HIF-2和HIF-3。該家族蛋白行使功能時需要2個亞基,包括具有活性功能的HIF-α亞型(包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和組成表達的β亞基(HIF-1β)。HIF-1活性形式以HIF-1α和HIF-1β異二聚體蛋白復合物存在，屬于bHLH-PAS類轉錄因子。HIF-1α相對分子質量為120 000，其表達隨著細胞氧氣濃度的降低而增加，在所有類型組織均有表達。HIF-1β相對分子質量為90 000,表達水平不受氧分子濃度調控，在常氧和缺氧條件下均在細胞核內穩定表達。目前認為HIF-1β的作用主要維持HIF-l異二聚體的穩定性以及活性構象轉變等結構性功能。HIF-2α或稱HRF/EPAS-1/HLF，是在克隆HIF-1α亞基的同源物時發現[6]。研究[7]表明，與HIF-1α的泛表達模式不同，HIF-2α主要局限在膠質母細胞瘤和血管母細胞瘤中表達，HIF-3α的研究則相對有限。

HIF-1α的活性調控主要包括三個層次，即mRNA水平、蛋白質水平以及高級結構(二聚化)水平[8]。蛋白質的水平調控主要通過HIF-1α蛋白的羥化、乙酰化、磷酸化等三種蛋白修飾方式完成[9]。在常氧條件下，脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylases，PHD)羥化HIF-1α的氧依賴性降解結構域的兩個脯氨酸，腫瘤抑制蛋白pVHL識別并結合羥基化的脯氨酸殘基，募集elongin C和elongin B等泛素蛋白形成泛素連接蛋白酶復合體，啟動多泛素化降解途徑。除HIF-1α外，氧氣還通過天冬酰胺基羥化酶HIF-1抑制因子(factor inhibiting HIF-1，FIH)修飾HIF-1α的C端結構，抑制其轉錄活性[10-11]。缺氧條件下，因PHD 和FIH均失活，導致HIF-1α的泛素化降解抑制和轉錄抑制均被解除，HIF-1α穩定并在細胞內積累，由核定位信號介導入核并與HIF-1β結合成具有活性的完整HIF-1復合物，識別缺氧反應性DNA元件，并結合轉錄共因子p300誘導低氧靶基因的轉錄。部分研究利用2-氧戊二酸類似物、重金屬和鐵螯合劑等，抑制PHD和FIH活性，提高HIF-1α的穩定性(或假性低氧)，從而模仿缺氧情況下的生物反應。

2 HIF-1參與HIE的靶基因

缺氧條件下，HIF-1α易位至核后形成HIF異二聚體，結合至靶基因上游的HRE中的核心共有序列5′-(A/G)CGTG-3′。此外，靶基因的啟動子還具有HIF輔助序列(HIF ancillary sequence，HAS)，序列為HRE的反向重復，即(5′-CAGGT-3′)。KIMURA等[12]通過定點誘變和熒光素酶報告系統發現，HAS序列缺失或者改變后VEGF和EPO報告基因的表達受阻。除缺氧外，還有許多非缺氧刺激能夠上調該轉錄因子，包括生長因子、細胞因子、自由基和激素等。目前發現約有70多種HIF的直接靶基因參與正常生理和疾病過程。按功能主要包括血管生成和氧氣供應、細胞干性和自我更新、細胞增殖、上皮向間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、轉移和侵襲、氧化還原穩態以及細胞凋亡(見表1)。本文重點探討EPO、VEGF、COX-2、GLUT-1與糖酵解酶類等與HIE相關的靶基因。

表1 HIF的靶基因及參與生物過程

2.1 EPO EPO是發現的首個HIF靶基因，為一種激活紅細胞生成的激素類糖蛋白[13]。缺氧情況下EPO的表達水平提高是形成紅細胞所必要條件，是在缺氧情況下機體提高輸氧能力的一種反應[14-15]。EPO最初認為是參與紅系祖細胞的成熟和增殖的關鍵基因，而后來的免疫組織化學研究表明，EPO廣泛存在于哺乳動物的腦細胞中，而EPO受體也在包括星形膠質細胞、神經元、內皮細胞和小膠質細胞等大多數腦細胞中廣泛表達[16]。KAWAKAMI等[17]發現，缺氧情況下HIF-1α能抑制谷氨酸等興奮性氨基酸的釋放，從而發揮腦保護的作用。KAWAKAMI等[17]以體外培養的小腦神經元顆粒作為谷氨酸釋放源，加入EPO后谷氨酸釋放受到抑制且神經元數目提高。KELLER等[18]在新生大鼠缺血缺氧模型中發現，EPO能抑制NMDA受體從而實現神經保護作用。EPO促進血紅蛋白合成,是血液系統在缺氧時的重要代償機制。但EPO的過量生成則會導致血小板黏附聚集增多，血容量和血液黏度提高，對HIE的恢復具有負面作用[15]。

2.2 VEGF 血管生成是一個復雜的過程，涉及由不同細胞類型表達的多種基因產物。腦缺血后，HIF-1α可以激活VEGF，VEGFR-1和PAI-1等血管生成相關基因,驅動生理和病理性血管生成，進而改善腦缺血狀態[19]。MATSUDA等[20]在大鼠腦缺血模型的大腦表面轉染HIF-1α DNA，結果發現HIF-1α和VEGF表達水平明顯高于對照組，同時側支循環數量顯著增加，表明HIF-1α顯著增加新生血管生成。缺氧程度對于VEGF的功能影響較大。當缺氧程度為輕度或者中度時，HIF-1結合在VEGF的增強子區域的HRE序列增強VEGF表達，增強低氧區域周圍細胞的存活率[21-22]。當缺氧非常嚴重且持續較長時間時，過量的VEGF則直接導致血管重塑，血腦屏障的通透性增加，引發和加重HIE引起的腦水腫等[23]。

2.3 iNOS和環氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2) iNOS和COX-2在HIE中通過通過炎癥誘導導致腦損傷，均是HIF-1靶基因[24-25]。已證明COX-2的表達水平降低與新生兒腦損傷的減輕程度相關，而COX-2和iNOS的表達水平提高則伴隨HIE后神經元的丟失[26]。COX-2抑制劑能改善新生兒腦損傷程度的減輕和神經行為等預后的，并且效能持續性較強，表明可能實現了對神經血管單位的有效保護。缺氧時，HIF-1參與內皮細胞中COX-2的上調，從而催化類花生酸的產生。在成年大腦中發生局灶性腦缺血后，HIF-1介導的iNOS明顯上調。但是，關于iNOS參與新生兒HII后神經炎癥的研究卻存在明顯爭議。iNOS的主要細胞來源是星形膠質細胞和小膠質細胞，它們都在新生兒HIE后被激活。報道發現缺氧缺血后P12大鼠僅iNOS的少量表達。同時，發現在缺氧缺血后iNOS的表達沒有改變，或者在缺氧后在P0和P7年齡小鼠中iNOS mRNA的顯著下降[27]。

2.4 GLUT-1及糖酵解酶類 編碼幾乎所有糖酵解酶的基因都直接被HIF上調[28]。研究[29]表明，低氧預處理能顯著增高新生大鼠的HIF-1α水平，同時GLUT-1以及多種糖酵解酶類的活性提高，從而保證腦組織能量充分以減輕腦損傷。PAPANDREOU等[30]發現，在缺血缺氧情況下，HIF-1α能提高丙酮酸脫氫酶激酶-1的表達水平，同時抑制丙酮酸脫氫酶活性，緩解腦損傷。

3 HIF-1α與HIE中的細胞凋亡

HIF控制許多凋亡基因，包括Bcl-2、BNIP3、NIX(或BNIP3L)和NOXA。其中，已證明BNIP3通過不依賴caspase的細胞死亡機制促進了發育中的皮質中的細胞損傷[31-32]。盡管眾所周知，在新生兒大腦中，細胞凋亡的過程很大程度上依賴于caspase-3。針對兩種類型的細胞凋亡是新生兒腦損傷的合理治療選擇。此外，對大鼠caspase 3/9啟動子分析顯示了HIF-1結合元件[33]。

3.1 HIF-1參與細胞凋亡 新生兒HI期間和之后，神經元細胞會發生凋亡。HIF-1α參與缺氧誘導的細胞凋亡主要為兩種可能的途徑。首先，HIF-1α增加了腫瘤抑制蛋白p53的穩定性，從而誘導細胞凋亡[34]。在皮質神經元中使用皰疹擴增子介導的基因轉移，表達能夠破壞缺氧依賴性轉錄的顯性負性形式的HIF-1α，減少了因缺氧葡萄糖而導致的延遲性神經元死亡。相反，耐缺氧的p53無效的原代培養物不受HIF-1α表達的保護[35]。此外，另一項體外研究[36]表明，在缺氧狀態下，HIF-1α消除了p53的降解，抑制了p53的泛素化并阻止了p53的核輸出，從而導致了凋亡相關基因的表達增加。其次，HIF-1α的過表達還誘導BNIP3的表達增加，從而可以誘導新生大鼠腦細胞凋亡[31-32]。盡管HIF-1α可以增加p53和BNIP3的表達，但這些分子參與了兩個獨立的凋亡途徑。PEREIRA等[37]使用HeLa細胞進行的體外研究結果表明，沒有HIF-1α的p53的過表達不能誘導BNIP3的轉錄，但是其機制尚不清楚。

3.2 HIF-1的抗細胞凋亡活性 HIF-1α也可能因為高表達而對缺氧誘導的凋亡具有更高的抵抗力[38]。在輕度低氧的大鼠模型中，大鼠腦中HIF-1α有明顯且持續的反應，而未檢測到細胞凋亡。在急性缺氧體外模型中，與野生型細胞相比，具有HIF-1α蛋白組成型表達的細胞對凋亡的抵抗力更高?？沟蛲鲎饔玫脑敿殭C制尚不清楚。據推測，HIF-1α的持續表達通過在慢性低氧時增加EPO等抗凋亡因子的表達而具有抗凋亡作用，并在急性低氧時增加無氧代謝[33]。

由于HIF-1α參與促凋亡和抗凋亡過程，因此需要研究這兩種矛盾效應之間的關系。新生兒腦細胞凋亡的誘導取決于缺氧的嚴重程度：在輕度缺氧條件下，p53水平較低，HIF-1α被HIF-1β磷酸化和二聚化，從而導致轉錄激活抗凋亡基因例如EPO的表達[34]。但是，更持續或更嚴重的缺氧條件會導致HIF-1α脫磷酸化并導致p53水平整體升高。這導致形成一種新的轉錄復合體，該復合體同時包含兩種與病理基因(如Bax)的反式激活有關的蛋白質[39]。一項使用小鼠缺血模型的研究表明，腦缺血后HIF-1α激活有兩個階段[40]。第一階段發生在缺血后持續到24 h，并且與大多數促凋亡基因的上調相關；而在第二階段，HIF-1α激活從缺血后48 h至8 d，大部分是抗凋亡基因被誘導。

4 HIF-1α與壞死

細胞壞死是HIE后神經元最早期的死亡途徑，在使用P7大鼠HI模型進行的研究中，壞死性神經元細胞的死亡主要集中在缺血核心，而凋亡性神經元的細胞主要分布在缺血性損傷較輕的區域[41]。神經元細胞是氧敏感細胞，這意味著細胞對缺氧有反應，細胞質游離鈣的增加是由于細胞外鈣的大量流入和內質網中鈣的釋放共同引起的。鈣流入激活了與細胞壞死有關的幾種蛋白質，例如鈣蛋白酶[42]。體外研究[43]表明，鈣蛋白酶的激活參與了調控HIF-1α的降解。這種降解是通過增加細胞內鈣引起的，當PHD活性被阻斷時，鈣蛋白酶途徑被激活。鈣蛋白酶介導的HIF-1α降解可能與了解鈣波動引起的長期和/或嚴重缺氧期間HIF-1α的低濃度有關。盡管鈣內流激活鈣蛋白酶介導的HIF-1α降解，有研究表明在I型頸動脈細胞中,缺氧期間細胞內鈣濃度的增加刺激了HIF-1α蛋白的翻譯[44]。也有學者[45]認為HIF-1α的穩定導致缺氧時細胞壞死。但是，這些作用可能僅限于腫瘤細胞，而在神經元中，HIF-1α的穩定可能導致存活[46]。盡管如此，HIF-1α與壞死之間的關系仍未完全闡明。

5 展望

HIF-1能通過調控多種靶基因表達而實現對于多個生命過程調控。HIF-1α在腦發育和缺氧缺血性腦損傷中起重要作用，并且該分子同時具有神經保護和神經毒性特性[22]。HIF-1α表達的調節涉及多種因素。盡管最近對新生腦損傷中對HI應答的分子機制的理解有了迅速的發展，但有關HIF-1α的許多問題仍有待回答。

在神經元細胞死亡或存活期間，HIF-1α表達的調節和HIF-1α的獨特作用尚不完全清楚，尤其是條件決定細胞死亡或存活的問題。缺氧后HIF-1α是誘導促凋亡還是抗凋亡的決定可能取決于HI的持續時間，病理刺激的類型和涉及的腦細胞類型等[34]。

基于對HIF-1α信號通路的理解，我們可以探尋治療HIE的新途徑。首先，可以用PHD抑制劑調節HIF-1α的產生來促進神經保護性靶基因(如EPO和VEGF)的表達[47]。其次，也可以通過抑制HIF-1α的去磷酸化或用抗氧化劑下調其表達,例如p53和BNIP3誘導的細胞凋亡被阻斷[48]。第三，可以通過預處理提高HIF-1α的穩定性，是預防HIE另一個重要方向。從治療的角度看，應更加關注在新生兒HIE發生前未接受產前低氧預適應的窒息新生兒。HIF-1α的大多數特性僅通過實驗測試，需要通過轉化性研究進一步驗證方案可行性[49]。