葉酸缺乏對(duì)L02細(xì)胞增殖、凋亡及紡錘體組裝檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

任歡歡，楊 瑜，徐洪寶，王忠邁，程 宗，梁 猛，王春景，廖亞平

紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindle assembly checkpoint，SAC)是細(xì)胞周期調(diào)控中的眾多檢查點(diǎn)之一，有助于維持細(xì)胞有絲分裂期間基因組穩(wěn)定性，SAC結(jié)構(gòu)功能異常是導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性與非整倍體的重要原因之一，Mad2、Bub1、BubR1是SAC中的關(guān)鍵組分。

葉酸是一碳代謝循環(huán)中重要的甲基供體，在DNA合成、穩(wěn)定性及修復(fù)中起關(guān)鍵作用。其缺乏會(huì)導(dǎo)致DNA損傷、染色體和基因組不穩(wěn)定等。葉酸缺乏會(huì)對(duì)損壞SAC網(wǎng)絡(luò)，從而致使細(xì)胞發(fā)生有絲分裂異常與非整倍性[1]，但是非整倍體發(fā)生的機(jī)制尚不明確且葉酸缺乏對(duì)SAC影響的報(bào)道較少。本研究通過(guò)探索不同濃度葉酸對(duì)L02細(xì)胞增殖、凋亡及Mad2、Bub1、BubR1 mRNA及蛋白水平的影響，并討論可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 L02細(xì)胞(武漢普諾賽細(xì)胞庫(kù))；無(wú)葉酸RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；葉酸粉末(Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、PMSF(江蘇碧云天生物有限公司)；Mad2、Bub1、BubR1抗體(美國(guó)Bethyl公司)；β-actin抗體(Cell Signaling Technology 公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)；Mad2、Bub1、BubR1引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理 將L02細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組和不同濃度葉酸組(分別給予200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L葉酸處理2周)。

1.2.2 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后的L02細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將培養(yǎng)第12天的L02細(xì)胞按3.0×103個(gè)/孔接種于96孔板，各組3孔，過(guò)夜貼壁后，每孔加入10 μL CCK8試劑后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，并于450 mm處檢測(cè)吸光度(OD)值。

1.2.4 細(xì)胞周期試劑盒檢測(cè)細(xì)胞周期 將培養(yǎng)2周的L02細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，收集細(xì)胞；按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PI染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將培養(yǎng)2周的L02細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，收集細(xì)胞；按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Annexin V-FITC/PI進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達(dá)量 收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按照Takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR擴(kuò)增Mad2、Bub1、BubR1。根據(jù)GenBank上公布的人類Mad2、Bub1、BubR1序列，應(yīng)用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成(見(jiàn)表1)。同一標(biāo)本β-actin作為內(nèi)參照，采用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。qRT-PCR的反應(yīng)條件:95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列

1.2.7 Western blotting檢測(cè)Mad2、Bub1、BubR1的蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，BCA蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度，取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)到PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉室溫封閉2 h。室溫孵育一抗Mad2、Bub1和BubR1(1∶1 000稀釋)1 h，洗膜3次，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h，細(xì)洗膜3次。ECL顯色后置于凝膠成像儀中曝光，Image J進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 葉酸對(duì)L02細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 與正常對(duì)照組相比，20 nmol/L與0 nmol/L葉酸培養(yǎng)2周后，細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則，0 nmol/L葉酸組現(xiàn)象更加顯著(見(jiàn)圖1)。

2.2 葉酸對(duì)L02細(xì)胞增殖活性的影響 與正常對(duì)照組相比，200 nmol/L、20 nmol/L組與0 nmol/L細(xì)胞活性明顯降低(P<0.01)；與200 nmol/L相比，20 nmol/L與0 nmol/L組細(xì)胞活性明顯降低(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對(duì)細(xì)胞增殖能力(OD450值)的影響

2.3 葉酸對(duì)L02細(xì)胞周期的影響 與正常對(duì)照組相比，200 nmol/L組細(xì)胞G1/G0期、S期均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；20 nmol/L組和0 nmol/L組細(xì)胞G1/G0期明顯降低(P<0.01)、S期明顯升高(P<0.01)。與200 nmol/L相比，20 nmol/L組和0 nmol/L組細(xì)胞G1/G0期明顯降低(P<0.01)、S期明顯升高(P<0.01)。與20 nmol/L組相比，0 nmol/L組S期明顯增加、G1/G0期明顯減少(P<0.01)(見(jiàn)表3)。

表3 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.4 葉酸對(duì)L02細(xì)胞凋亡的影響 與正常對(duì)照組相比，200 nmol/L組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；20 nmol/L組細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05)，0 nmol/L組細(xì)胞明顯發(fā)生凋亡(P<0.01)。與200 nmol/L相比，20 nmol/L組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，0 nmol/L組凋亡率明顯增加(P<0.01)。與20 nmol/L組相比，0 nmol/L組凋亡率明顯增加(P<0.01)(見(jiàn)圖2、表4)。

表4 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.5 葉酸對(duì)L02細(xì)胞Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達(dá)量的影響 與正常對(duì)照組相比，葉酸濃度為200 nmol/L時(shí)，Bub1 mRNA的表達(dá)量增加(P<0.05),Mad2和BubR1 mRNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；葉酸濃度為20 nmol/L及0 nmol/L時(shí)，Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達(dá)量均明顯增加(P<0.01)(見(jiàn)表5)。

表5 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對(duì)SAC相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 葉酸對(duì)L02細(xì)胞Mad2、Bub1、BubR1蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，200 nmol/L組Bub1蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)，20 nmol/L、0 nmol/L組Bub1 蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L組Mad2和 BubR1蛋白表達(dá)量均明顯增加(P<0.01)(見(jiàn)圖3、表6)。

表6 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對(duì)SAC相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究顯示[2]葉酸濃度為120 nmol/L時(shí)便可維持人淋巴細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選取略高于基因組穩(wěn)定的葉酸濃度即200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L作為實(shí)驗(yàn)組。CCK8結(jié)果顯示葉酸濃度為200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L時(shí)葉酸增殖受到了明顯抑制，細(xì)胞周期與凋亡結(jié)果顯示，葉酸濃度為200 nmol/L時(shí)，L02細(xì)胞G1/G0期、S期及凋亡率均值與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。葉酸濃度為20 nmol/L、0 nmol/L 細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，凋亡數(shù)量增多，且葉酸濃度越低S期阻滯越明顯、細(xì)胞凋亡數(shù)量越多。COURTEMANCHE等[3]的研究顯示葉酸缺乏可以降低細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯，本研究與上述研究結(jié)果相符合。LIANG等[4-5]研究表明葉酸缺乏誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1/G0期阻滯，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，在G1/G0期阻滯與凋亡之間建立了聯(lián)系。HUANG等[6]研究結(jié)果顯示在葉酸缺乏的培養(yǎng)基中HepG2細(xì)胞葉酸濃度較低，細(xì)胞在S期積累隨后發(fā)生G2/M期阻滯，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。低葉酸缺誘導(dǎo)的DNA的損傷程度具有凋亡反應(yīng)，這是葉酸缺乏引起細(xì)胞凋亡的原因之一。本研究中，當(dāng)葉酸濃度為20 nmol/L、0 nmol/L時(shí)細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究與上述研究結(jié)果有所不同，本研究結(jié)果顯示葉酸缺乏時(shí)細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，我們認(rèn)為差生差異的原因可能是由于所用細(xì)胞系、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間不同造成的。

SAC作為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)對(duì)于維持細(xì)胞周期正常進(jìn)行至關(guān)重要，Bub1參與染色體排列，Mad2和BubR1通過(guò)結(jié)合底物CDC20，阻止CDC20激活A(yù)PC/C以達(dá)到抑制APC/C的效果，防止細(xì)胞提前進(jìn)入后期。SAC作為細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制，其某些成分的異常表達(dá)會(huì)使SAC功能發(fā)生改變，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和非整倍體。對(duì)果蠅和小鼠的研究均證實(shí)了SAC在維持染色體穩(wěn)定方面的重要性[7-11]，在SAC發(fā)生突變的細(xì)胞中，有絲分裂錯(cuò)誤的發(fā)生率很高，導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞的比例急劇增加[11-12]。在一項(xiàng)宮頸癌研究中[13]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Mad2和BubR1可以促進(jìn)SiHa細(xì)胞增長(zhǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力，抑制細(xì)胞凋亡，降低藥物治療作用[13]。并且下調(diào)Mad2可以通過(guò)調(diào)控磷酸化survivin的活化，調(diào)控胃癌細(xì)胞周期，增加增殖，提高胃癌細(xì)胞的耐藥性[14]。另一項(xiàng)對(duì)乳腺癌研究[15]中，與KrasG12D或Her2同時(shí)在成年小鼠乳腺中過(guò)表達(dá)有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白Mad2，會(huì)導(dǎo)致有絲分裂檢查點(diǎn)過(guò)度激活，過(guò)早的Mad2表達(dá)會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)烈的有絲分裂停止和細(xì)胞死亡增加。用特異性的小干擾RNA敲低紡錘體檢查點(diǎn)蛋白BubR1或Mad2，可顯著減少6,7-二甲氧基-3-(3-甲氧基苯基)異喹啉-1-胺(CWJ-082)誘導(dǎo)的有絲分裂細(xì)胞積累和凋亡[16]。印度的一項(xiàng)藥物研究[17]也顯示，過(guò)表達(dá)的Mad2通過(guò)恢復(fù)適當(dāng)?shù)暮笃趩?dòng)和維持更多的細(xì)胞存活，部分地挽救了藥物的有害作用。在肝細(xì)胞性癌組織和細(xì)胞中，miR-490-5p的過(guò)表達(dá)或Bub1的過(guò)表達(dá)抑制了肝細(xì)胞性癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，增加了凋亡率[18]。缺少Bub1的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞不能使其染色體對(duì)齊或維持SAC功能[19]。本研究結(jié)果顯示，葉酸濃度為200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L時(shí)Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達(dá)量明顯增加，Western blotting檢測(cè)也顯示在蛋白水平上Mad2、Bub1、BubR1表達(dá)量明顯增加。

結(jié)合上述研究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出這樣一個(gè)結(jié)論：對(duì)于SAC來(lái)說(shuō)葉酸濃度為200 nmol/L已經(jīng)達(dá)到一種缺乏狀態(tài)，Mad2、Bub1、BubR1的高表達(dá)用于增加SAC的活性，可以維持細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)葉酸極度缺乏時(shí)(20 nmol/L和0 nmol/L)，SAC功能活性受到了嚴(yán)重?fù)p害，Mad2、Bub1、BubR1的高表達(dá)不足以維持其正常活性，有絲分裂出現(xiàn)異常，可能導(dǎo)致非整倍體及染色體不穩(wěn)定的發(fā)生，使得細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜上所述，本研究結(jié)果顯示，對(duì)于L02細(xì)胞來(lái)說(shuō)葉酸濃度為200 nmol/L時(shí)已經(jīng)達(dá)到一種缺乏狀態(tài)，葉酸缺乏時(shí)SAC功能異常，可能是阻礙細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的原因。