基于生物信息學的食管鱗癌關(guān)鍵基因篩選

蘇毅馨,李林潞,毛 昀，褚雪鐳，陳 崢，朱世杰

(中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院腫瘤科，北京 100102)

食管癌是常見惡性腫瘤之一，每年造成40多萬人死亡[1]，2018年中國食管癌新發(fā)病例占全球新發(fā)病例54.1%，死亡病例占全球死亡病例56%[2]。食管鱗癌(ESCC)是主要的組織學亞型，占90%以上[3]。目前常規(guī)治療方式包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療、免疫治療等，但ESCC患者的5年生存率低于30%[4]。研究表明，相關(guān)基因及信號通路的改變可導致腫瘤細胞的早期轉(zhuǎn)移及高侵襲性，如RTK/RAS/PI3K通路中TP53、 CCND1基因突變等[5]，因此亟須進一步探討ESCC分子機制，以期尋找ESCC早期診斷及靶向治療潛在的生物標志物。

近年來，基因芯片技術(shù)及生物信息學已廣泛應(yīng)用于基因組學的研究，LU等[6]分析ESCC中DNA甲基化驅(qū)動基因，發(fā)現(xiàn)ABCD1、CCDC8等基因異常與患者生存預后相關(guān)。本研究通過整合公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(GEO)中GSE17251、GSE45670基因芯片數(shù)據(jù)集，利用GEO2R和Venn圖在線工具獲得兩數(shù)據(jù)集中共同差異表達基因(DEGs)，其次通過DAVID在線網(wǎng)站及R語言進行基因本體(GO)和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)分析并將其可視化，然后，通過SPRING在線工具及Cytoscape軟件中MCODE(Molecular Complex Detection Technology)插件篩選出核心DEGs。最后將核心DEGs導入GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)在線數(shù)據(jù)庫進行表達差異及預后分析獲得與ESCC預后相關(guān)基因，并利用UALCAN在線數(shù)據(jù)庫驗證其在ESCC組織與正常組織表達差異性，探索ESCC預后的相關(guān)生物標志物。

1 材料與方法

1.1 ESCC數(shù)據(jù)收集及差異基因篩選

NCBI(National Center for Biotechnology Information)平臺GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是公開的微陣列/基因圖譜公共數(shù)據(jù)庫，利用該數(shù)據(jù)庫進行基因芯片篩選。目標芯片的準入標準：(1)臨床ESCC患者標本，排除細胞株和動物實驗；(2)入選芯片需含有ESCC組織標本和正常組織標本；(3)入選芯片標準為相同平臺。

確定目標芯片后，利用在線工具GEO2R分析各個芯片數(shù)據(jù)，設(shè)置篩選標準為：|logFC|>2，P<0.05，然后利用Venn軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)進行在線檢測，搜集DEGs。其中l(wèi)ogFC<0為下調(diào)基因，而logFC>0為上調(diào)基因。

1.2 基因功能注釋與通路富集分析

DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery Database)生物信息資源數(shù)據(jù)庫整合了生物數(shù)據(jù)和分析工具，能夠?qū)蚝偷鞍踪|(zhì)進行功能注釋。通過DAVID進行在線分析，以人源基因為背景進行GO和KEGG對差異基因進行GO分析及KEGG信號通路富集分析，并利用R語言將其可視化。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將DEGs導入在線STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，然后運用Cytoscape3.6.0軟件中MCODE插件檢測核心基因，篩選標準：degree cutoff=2；node score cutoff=0.2；k-core=2；max.depth=100。

1.4 核心基因驗證與預后的關(guān)系

通過GEO數(shù)據(jù)庫的挖掘，明確差異表達的核心基因，利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析核心基因表達差異性及預后相關(guān)性，篩選條件P<0.05；其次利用UALCAN在線工具(http://ualcan.path.uab.edu/)進行驗證。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達基因

根據(jù)納入標準，篩選出兩個符合要求的微陣列數(shù)據(jù)集，分別為GSE17251、GSE45670 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)，均來自GPL570平臺。GSE17251包含5例ESCC組織標本和5例正常食管組織標本，GSE45670包含28例ESCC組織標本和10例正常食管組織標本，共得到33例ESCC組織及15例正常組織。利用GEO2R分析從GSE17251、GSE45670芯片中分別得到差異基因161、1 087個，其中上調(diào)基因分別為81、403個，下調(diào)基因為80、684個。利用Venn軟件發(fā)現(xiàn)2個數(shù)據(jù)集共表達的差異基因有86個，其中54個為高表達基因和32個低表達基因(圖1、表1)。

A:所有差異表達基因；B：上調(diào)差異表達基因；C：下調(diào)差異表達基因。

表1 86個差異表達基因上調(diào)基因及下調(diào)基因

2.2 差異表達基因GO功能注釋分析及KEGG通路富集分析

依據(jù)基因編碼的蛋白質(zhì)在細胞中的作用，GO分析將DEGs功能注釋的結(jié)果分為3類：生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)。將差異基因進行GO分析，篩選為P<0.05的結(jié)果(表2、圖2)。表明在生物過程中，主要富集在細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、蛋白激酶活性的激活、細胞增殖的調(diào)控、內(nèi)皮細胞分化、細胞有絲分裂、有絲分裂中期/后期轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)、胰島素樣生長因子受體信號通路的正向調(diào)控、磷酸化的正調(diào)控;在細胞組分中，包括紡錘體中央?yún)^(qū)、核質(zhì)、Ndc80復合物、驅(qū)動蛋白復合物、軸突丘；在分子功能中，包括ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活性、RNA聚合酶核心啟動子近端區(qū)序列特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合等。

表2 ESCC差異表達基因GO富集分析

續(xù)表2 ESCC差異表達基因GO富集分析

圖2 GO功能富集分析結(jié)果

通過對腫瘤組織和正常ESCC組織的差異進行進行KEGG通路富集分析并利用R語言將其可視化(圖3)，結(jié)果表明：主要集中在25條信號轉(zhuǎn)導通路上，包括ECM受體結(jié)合、蛋白質(zhì)消化、TGF-β信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂、血管平滑肌收縮、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)、PI3K-AKT信號通路、小細胞肺癌等。

圖3 KEGG通路富集分析

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化

將86個差異基因?qū)氲絊TRING網(wǎng)站構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖4)，剔除孤立節(jié)點后，運用Cytoscape 3.6.0軟件中MCODE插件按照篩選核心基因，篩選到27個關(guān)鍵核心基因(圖5)。

A:CDKN3對ESCC患者OS影響；B：KIF4A對ESCC患者OS影響。

2.4 核心基因驗證與預后的關(guān)系

通過GEO數(shù)據(jù)庫的挖掘，明確差異表達的核心基因27個，利用GEPIA篩選出預后相關(guān)基因結(jié)果表明：CKDN3、KIF4A基因在ESCC組織中高表達(圖6)，并且高表達組的總生存期明顯短于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7，經(jīng)UALCAN驗證結(jié)果一致(圖8)。

A:CDKN3在ESCC患者高表達；B：KIF4A在ESCC患者高表達。

A:UALCAN驗證CKDN3在ESCC患者高表達；B：UALCAN驗證KIF4A在ESCC患者高表達。

3 討 論

食管癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有病死率高及預后差等特點，順鉑和5-氟尿嘧啶(5-FU) 的標準化療方案中位生存時間為201.5 d，1年生存率為27.8%[7]。近年來，伴隨測序技術(shù)的進步，基因圖譜和基因芯片在科研領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，促進了對包括ESCC在內(nèi)的腫瘤異質(zhì)性理解，并為識別新的癌癥基因和預后生物標志物提供一個強有力的方法[8]。如研究表明CCND1、CTTN、EGFR、TP63和CDKN2A[9]與ESCC密切相關(guān)，ANO1可能與ESCC的預后生物標志物[10]。但目前ESCC發(fā)病的分子機制尚未明確，迫切需要找到可用的潛在生物標志物，生物信息學可幫助探索基因?qū)用姘l(fā)生的變化、識別潛在的生物標志物。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出GSE17251和GSE45670兩個芯片數(shù)據(jù)集，共納入33例ESCC組織及15例正常食管組織。通過GEO2R和Venn軟件發(fā)現(xiàn)86個共有 DEG，包括54個上調(diào)DEGs和32個下調(diào)DEGs。在GO分析及KEGG分析中，主要富集在細胞增殖的調(diào)控、細胞周期、細胞分化、DNA復制、PI3K-Akt信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂等方面。食管鱗狀細胞癌的演變是一個多步驟的過程，細胞損傷的累積可導致細胞增殖異常及基因不穩(wěn)定性，細胞周期失控、細胞分化異常是惡性腫瘤的標志，在腫瘤的致癌或進展過程中發(fā)揮重要作用，如TP53、CDKN2A基因突變與早期食管腫瘤細胞分化相關(guān)[11]，NF750和NOTCH1的突變可影響食管鱗狀細胞的成熟導致癌變[12]，HERG1基因可通過影響PI3K/AKT信號通路促進ESCC細胞增殖、遷移和侵襲[13]。

通過SPRING及Cytoscape3.6.0軟件插件構(gòu)建DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)27個高表達的核心基因，經(jīng)GEPIA分析并通過UALCAN驗證CKDN3、KIF4A在ESCC組織的高表達提示預后狀態(tài)不良。CDKN3基因?qū)儆?CDC14s家族，位于染色體位置14q22，包含21個氨基酸，相對分子質(zhì)量23×103，是一種雙特異性磷酸酶蛋白，可對磷酸化絲氨酸/蘇氨酸發(fā)揮去磷酸化作用調(diào)控細胞周期進程，既往在多種腫瘤中報道，不同類型腫瘤組織中發(fā)揮不同作用，不僅參與細胞周期調(diào)控，對細胞凋亡及侵襲遷移能力也有影響[14]。其作為促癌基因在肺癌、宮頸癌、肝癌中CDKN3高表達提示預后不良[15]，在診斷方面，CDKN3高表達識別宮頸癌組織的靈敏度達93%，特異度達96%[16]，但在ESCC中的生物學功能尚不清楚。YU等[17]研究報道CDKN3在ESCC細胞系中表達上調(diào)，通過激活ESCC細胞的AKT信號通路促進細胞增殖和侵襲。CDKN3敲除可降低ESCC細胞的增殖、侵襲和遷移能力，抑制細胞G1/S期轉(zhuǎn)化，與LIU等[16]實驗結(jié)果一致，其可通過AKT-p53-p21通路促進ESCC細胞增殖侵襲。KIF4A屬于驅(qū)動蛋白家族4(KIF4),參與紡錘體組織、染色體排列，在細胞有絲分裂、DNA損傷修復、腫瘤發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要的作用，在乳腺癌、肺癌、肝癌[18-20]等多種腫瘤組織中高表達,并可作為非小細胞肺癌、乳腺癌的預后因素[18-19]，F(xiàn)OXM1通過調(diào)節(jié)KIF4A的表達促進肝細胞癌的進展[20],但缺乏ESCC中的生物學功能研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析在不同的微陣列數(shù)據(jù)集的基礎(chǔ)上識別出ESCC組織和正常食管組織之間的兩個DEGs(CKDN3、KIF4A)在ESCC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中作用，在基因?qū)用鏋閷ふ倚碌姆肿影悬c提供了一定的支持，也為實現(xiàn)ESCC的精準治療提供了一個新思路，但還需進一步進行實驗以驗正相關(guān)結(jié)果。