S100A6 基因表達對肺腺癌細胞組織的影響

蔡洲，肖琛嫦，梅燕

（武漢科技大學城市學院醫學部，湖北 武漢 430083）

0 引言

肺腺癌是一種非小細胞肺癌，主要起源于支氣管黏膜上皮[1-2]。目前，肺腺癌的確切發病機制尚不十分明確，大量的醫學資料表明吸煙、環境污染、放射、肺部慢性疾病及內分泌失調等均可能誘發肺腺癌發生。S100A6 屬于S100 蛋白家族，能夠通過靶蛋白參與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡，是一種與腫瘤發生和發展有關的重要標志物[3-4]。南巖東[5]等人在研究中提到，S100A6 在判斷正常肺組織和肺癌方面具有高靈敏度和特異度，診斷準確率由于其他腫瘤標志物，可作為肺腺癌早期診斷與預后判斷的參考指標。本研究將肺腺癌細胞組織的表型特征作為研究重點，旨在明確S100A6 基因表達對肺腺癌細胞組織的影響，為臨床上確定S100A6 的主要作用機制提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年5 月至2018 年2 月某院收治的34例肺腺癌患者的正常肺組織、癌旁組織及肺腺癌組織標本，其中男18 例，女16 例，年齡23～78 歲，平均（52.6±3.8）歲。A549 肺腺癌細胞由上海中科院提供。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌細胞轉染方法

將A549肺腺癌細胞接種于RPMI1640培養液中（含100g/L 胎牛血清+100U/mL 青霉素+100μg/mL 鏈霉素），培養一段時間后將對數生長期細胞接種于培養板，細胞融合60%后轉染攜帶S100A6 基因+綠色熒光蛋白的質粒，構建S100A6 陽性組。

1.2.2 S100A6 蛋白表達量檢測方法

在標本勻漿中加入細胞裂解液，離心15min 后取上層清液，采用BCA 蛋白定量法進行測定。使用聚丙烯酰胺進行常規電泳，使用一抗4℃下孵育過夜，二抗室溫條件下孵育2h，采用化學熒光發光法進行顯色處理。S100A6 蛋白表達量=條帶吸光度值/GAPDH 吸光度值。

1.2.3 細胞增殖率、穿膜細胞數及細胞凋亡率檢測方法

采用MTT 法測定肺腺癌細胞增殖率，使用培養液（含10%胎牛血清）配置細胞懸液，以1000～10000個細胞/孔接種至96 孔板上，細胞生長60%后96h吸出，每孔加20μlMTT 溶液，孵育4h，吸除上層清液后加入150μl 二甲基亞砜，采用酶聯免疫法測定吸收值。取100μl 300mL/L 的無血清培養液，均勻涂抹在PET 膜表面，將生長期細胞濃度調整為105/mL，48h 后進行常規固定、染色，計算PET 膜下穿膜細胞數，取5 個視野平均值。對貼壁細胞進行PSB溶液洗滌和胰酶細胞消化液消化處理，貼壁細胞掉落后吸除消化液，離心5min 后去除上層清液，使用PBS 溶液重懸細胞。取50000～100000 重懸細胞，離心5min 后加入Annexin V-FITC 溶液及染色液，使用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.3 觀察指標

觀察并記錄S100A6 基因在正常肺組織、癌旁組織及肺腺癌組織的表達量，比較陽性組和陰性組的細胞增殖率、穿膜細胞數、細胞凋亡率及細胞周期分布。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，計數結果比較采用χ2檢驗，計量結果比較用t檢驗，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 S100A6 基因在正常肺組織、癌旁組織及肺腺癌組織的表達差異

S100A6 基因在正常肺組織、癌旁組織、肺腺癌組織的表達量分別為（0.247±0.069）、（0.486±0.213）、（0.796±0.328），見表1。

表1 S100A6 基因在正常肺組織、癌旁組織及肺腺癌組織的表達差異

2.2 S100A6 陽性組和陰性組細胞增殖率、穿膜細胞數和細胞凋亡率比較

陽性組的細胞增殖率、穿膜細胞數均明顯高于陰性組，細胞凋亡率顯著低于陰性組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 S100A6 陽性組和陰性組細胞增殖率、穿膜細胞數和細胞凋亡率比較

2.3 S100A6 陽性組和陰性組細胞周期比較

陽性組肺腺癌細胞S 期占（56.27±0.93）%，G2-M 期占（4.92±0.36）%，陰性組肺腺癌細胞S 期占（42.53±0.71）%，G2-M 期占（18.01±0.42）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。陽性組和陰性組的G0-G1 期肺腺癌細胞比例無顯著差異（P＞0.05），見表3。

表3 S100A6 陽性組和陰性組細胞周期比較（%）

3 討論

肺腺癌是一種腺上皮惡性腫瘤，主要表現為圓形或橢圓形腫塊，具有生長緩慢、可發生血行轉移的特點[6-7]。早期肺腺癌并不明顯的臨床癥狀，主要表現為咳嗽、胸悶、咯血、胸痛等一般呼吸系統癥狀，易被忽略。隨著疾病的不斷發展，患者開始出現胸痛、聲音嘶啞、面頸部水腫、胸腔積液等晚期癥狀。由于肺腺癌在早期階段即可出現轉移灶，如未得到及時有效的診斷和治療極有可能發生急速惡化現象，嚴重威脅患者的生命安全。S100A6 是一種酸性蛋白質，最早于腹水瘤組織中被發現，以螺旋結構為主要二級結構，主要廣泛分布與細胞膜、細胞質、核被膜及核膜表面，與十多種蛋白質存在直接的作用關系[8-10]。大量的研究證實，S100A6 基因在多種惡性腫瘤中出現過度表達現象，可能是參與腫瘤發生、發展和轉移的重要物質[11-12]。本研究數據顯示，與正常肺組織相比，癌旁組織和肺腺癌組織中的S100A6 蛋白表達量明顯升高，且肺腺癌組織中含量最高，提示S100A6 基因在肺腺癌細胞組織中呈過度表達。這是因為S100A6 是一種單拷貝基因，定位于I21 染色體上，該染色體在腫瘤分布區域存在明顯的缺失或重排現象，與腫瘤存在密切的相關性。目前，S100A6 基因在腫瘤細胞中的高表達已成為國內外學者的共識，但其與腫瘤細胞組織的關系尚待研究。本研究對肺腺癌細胞組織的表型特征進行了對比性分析，結果如下。

本次研究通過基因轉染技術構建S100A6 陽性肺腺癌細胞株，并采用MTT 法檢測肺腺癌細胞增殖率，結果發現S100A6 陽性組肺腺癌細胞增殖率高達（57.49±1.35）%，明顯高于陰性組的（40.12±1.28）%，提示S100A6 基因表達可能通過提高癌細胞增殖率參與腫瘤發展。既往的研究認為，S100A6 能夠通過與肌動蛋白、調鈣蛋白和原肌球蛋白相互作用改變細胞骨架，從而影響癌細胞黏附能力，促進細胞增殖[13-14]。在進一步的研究中，我們發現S100A6 陽性組穿膜細胞數明顯高于陰性組，表明S100A6 基因表達可對肺腺癌細胞的生物學行為產生影響，通過提高肺腺癌細胞遷移能力促進腫瘤浸潤和轉移。除了細胞增殖和細胞遷移能力外，細胞凋亡情況也是評價腫瘤發展情況的重要指標之一。研究結果顯示S100A6 陽性組的肺腺癌細胞凋亡率僅為（1.24±0.38）%，明顯低于陰性組，表明S100A6 基因的表達能夠在一定程度上抑制癌細胞凋亡，從而促進癌癥加重。一般情況下，腫瘤的發生是因為惡性轉化的癌細胞過度增殖引起，但從細胞凋亡的角度來看，腫瘤細胞打破了有序死亡秩序，凋亡機制收到影響而無法進行正常的死亡清除[15]。S100A6 基因的過度表達使得肺腺癌細胞凋亡率進一步降低，可能通過干擾癌細胞凋亡機制發揮作用。本次研究發現，S100A6 陽性組肺腺癌細胞S期占（56.27±0.93）%，明顯高于陰性組，而G2-M期僅占（4.92±0.36）%，與陰性組比較差異顯著（P＜0.05）。膜聯蛋白XI 是細胞內S100A6 蛋白的主要靶蛋白之一，肺腺癌細胞從分裂前期、間期到分裂中前期，膜聯蛋白XI 借助細胞內鈣離子濃度的變化逐漸從細胞核轉移至細胞核膜，與S100A6 完成匯合。至分裂中后期，細胞核膜開始崩解，S100A6和膜聯蛋白XI 共同沉積在鏈接細胞核膜和多肽的片層位置，分裂后期膜聯蛋白XI 參與核膜重建，分裂間期重歸細胞核，而S100A6 則在分裂中后期至分裂末期階段進行降解。S100A6 陽性組的肺腺癌細胞主要集中于S 期，是DNA 合成和組蛋白合成的主要階段，表明S100A6 基因表達能夠改變肺腺癌細胞分裂周期，使大多數癌細胞處于DNA合成期，從而參與腫瘤發展、侵潤和轉移。

綜上所述，S100A6 基因在肺腺癌細胞組織內過度表達，能夠促進癌細胞增殖，抑制癌細胞凋亡，并通過提高癌細胞遷移能力促使癌灶擴散。