云南省某規模化奶牛場乳房炎細菌的分離鑒定與耐藥性分析

王慧輝，王生奎，楊仕標，宋建領，趙文華，李富祥*

(1.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201； 2. 云南省畜牧獸醫科學院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224)

奶牛乳房炎在世界各地奶牛場中常發，是危害乳品行業最主要的疾病。該病可導致奶牛產奶量減少，乳成分變化和乳制品質量下降，嚴重的可導致奶牛死亡，嚴重危害奶牛健康和乳制品質量安全，給奶牛養殖場(戶)造成嚴重的經濟損失。臨床上將奶牛乳房炎分為3種類型，即臨床型乳房炎、亞臨床型乳房炎和慢性乳房炎。研究表明，奶牛乳房炎的致病菌有150多種，其中以大腸桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、支原體和金黃色葡萄球菌等最為常見[1]。目前，奶牛乳房炎的治療仍然以抗生素治療為首選方法，但隨著乳房炎細菌耐藥性的不斷增強，乳房炎的治療變得更加困難。因此，細菌分離鑒定和篩選敏感抗菌藥物，對奶牛乳房炎進行針對性治療具有重要的實際應用意義。本研究對云南某規模化奶牛場臨床乳房炎病例進行細菌分離鑒定，明確奶牛乳房炎細菌種類，并對分離株進行藥物敏感性試驗分析，為云南省奶牛乳房炎的預防和控制提供理論依據。

1 材料

1.1 樣品采集

2020年7月，在云南省某奶牛場隨機選擇臨床乳房炎奶牛24頭，用碘伏和75%酒精對乳區消毒，去掉前兩把奶，無菌收集4個乳區的混合乳樣，密封并做好標記，放置于冷藏箱中送至云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室進行細菌學診斷。

1.2 主要試劑

營養瓊脂培養基購自北京奧博星生物技術有限公司，細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，2×EasyTaq PCR SuperMix和Trans 2K DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司，22種細菌微量生化管和氧化酶試紙購自杭州濱和微生物試劑有限公司，18種藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司，氟苯尼考藥敏紙片購自英國OXOID公司。

2 方法

2.1 細菌分離

分別將24份乳樣劃線接種于營養瓊脂培養基上，37 ℃靜置培養過夜。觀察菌落形態，挑取典型單菌落進行純培養，將純培養得到的分離株進行編號。同時進行革蘭氏染色、鏡檢觀察菌體形態和染色特性。

2.2 細菌生化鑒定

用滅菌生理鹽水將營養瓊脂平板上的菌落洗脫下來制成菌懸液，接種22種細菌微量生化管，37℃培養過夜，按細菌微量生化管操作說明對各細菌分離株進行生化鑒定；按氧化酶試紙操作說明進行氧化酶試驗；過氧化氫酶試驗方法：用接種環將菌落挑至玻璃板上，滴加3%雙氧水，有氣泡產生者為過氧化氫酶試驗陽性。

2.3 細菌16S rDNA基因鑒定

按細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明分別提取各細菌分離株基因組DNA作為PCR模板，按參考文獻[2]介紹的方法對6株細菌的16S rDNA基因進行PCR擴增和測序。將測序結果用SeqMan軟件進行拼接，將拼接的16S rDNA基因序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對鑒定。

2.4 藥物敏感性試驗

參照美國臨床標準委員會(NCCLS) 推薦的K-B 瓊脂方法進行藥物敏感性試驗，每個營養瓊脂平板均勻貼5片藥敏紙片，將平板反轉，37 ℃培養18～24 h，從平板背面測量抑菌圈直徑(mm)。藥敏試驗結果判斷標準：直徑<10mm 為耐藥；10～15mm為中度敏感；≥15mm為高度敏感。

3 結果

3.1 細菌分離結果

用營養瓊脂培養基對細菌進行分離，分離到6株細菌(M1—M6)，其中M1分離株菌落中等大小，呈淡黃色，表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊；鏡檢為革蘭氏陰性小球桿菌，成對排列。M2分離株為灰白色小菌落，菌落表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊；鏡檢為革蘭氏陰性小球桿菌。M3分離株為灰白色小菌落，菌落表面光滑、圓形凸起，邊緣整齊、濕潤不透明；鏡檢為革蘭氏陽性球菌，堆聚成葡萄串狀。M4和M5分離株為灰白色細小菌落，菌落圓形、表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊；鏡檢為革蘭氏陽性小球菌，短鏈排列。M6分離株為灰白色中等大小菌落，菌落扁平，菌落表面不光滑、邊緣不圓整；鏡檢為革蘭氏陽性大桿菌。

3.2 細菌生化鑒定結果

生化鑒定結果顯示(見表1)，M1分離株氧化酶陰性、過氧化氫酶陽性、分解葡萄糖產酸，主要生化特征與變異不動桿菌模式菌株NIPH 2171相符[3]。M2氧化酶陰性、過氧化氫酶陽性、分解葡萄糖產酸、分解麥芽糖產酸，主要生化特征與偽魯氏不動桿菌模式菌株CCUG 67963相符[4]。M3分離株鳥氨酸脫羧酶陰性，分解葡萄糖、果糖、蔗糖產酸，不分解棉子糖和纖維二糖產酸等，主要生化特征與拉薩牦牛乳中分離的沃氏葡萄球菌相同[5]。M4和M5分離株分解乳糖產酸，不分解菊糖、木糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇產酸，主要生化特征與云南蒙自兩株奶牛停乳鏈球菌相同[6]。M6分離株過氧化氫酶陽性、分解葡萄糖產酸，鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶陰性、吲哚試驗陰性，不分解甘露醇、山梨醇、棉子糖、蔗糖、木糖和乳糖產酸，主要生化特征與副蕈狀芽孢桿菌相符[7]。

表1 分離株生化鑒定結果

3.3 細菌16S rDNA基因鑒定結果

16S rDNA基因序列BLAST比對結果顯示，M1—M6分離株分別與變異不動桿菌(Acinetobactervariabilis)、偽魯氏不動桿菌(Acinetobacterpseudolwoffii)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、停乳鏈球菌(Streptococcudysagalactiae)、停乳鏈球菌和副蕈狀芽孢桿菌(Bacillusparamycoides)的16S rDNA基因序列最高同源性分別為99.7%、99.6%、99.6%、100%、99.6%和99.7%。

根據菌落形態特征、革蘭氏染色菌體形態、生化試驗結果和16S rDNA基因鑒定結果，將M1—M6分離株分別鑒定為變異不動桿菌、偽魯氏不動桿菌、沃氏葡萄球菌、停乳鏈球菌、停乳鏈球菌和副蕈狀芽孢桿菌。

3.4 藥物敏感性試驗結果

表2 分離菌株藥敏試驗結果

4 討論

本研究從云南某規模化奶牛場臨床乳房炎乳樣中分離到變異不動桿菌(Acinetobactervariabilis)、偽魯氏不動桿菌(Acinetobacterpseudolwoffii)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、停乳鏈球菌(Streptococcudysagalactiae)和副蕈狀芽孢桿菌(Bacillusparamycoides)。其中變異不動桿菌、偽魯氏不動桿菌和副蕈狀芽孢桿菌的分離鑒定，表明云南奶牛乳房炎細菌存在豐富的多樣性，在奶牛乳房炎防控中應引起重視。

生化鑒定試驗中，沃氏葡萄球菌(M3)分離株尿素酶陰性、分解乳糖產酸、不分解麥芽糖產酸等生化特征與拉薩牦牛乳中分離的沃氏葡萄球菌不同[5]，表明其為不同的分離株。停乳鏈球菌(M4和M5)分離株分解麥芽糖產酸的生化特征與云南蒙自兩株奶牛停乳鏈球菌不同[6]。M4不分解果糖產酸而M5分解果糖產酸，表明M4和M5也為不同分離株。

奶牛乳房炎的致病菌多種多樣，常見的有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性曼氏桿菌、停乳鏈球菌等，不常見的有化膿隱秘桿菌[8]、沃氏葡萄球菌[9]等。本研究從奶牛乳房炎乳樣中分離到變異不動桿菌、偽魯氏不動桿菌和副蕈狀芽孢桿菌，這3種細菌在奶牛乳房炎中的致病作用有待進一步深入研究。