應用套式RT-PCR方法檢測文山州疑似豬瘟的病例報告

吳孟潔，趙敏，朱玲云，張紹衛，唐清，陳瑞雪

(1.文山州動物疫病預防控制中心，云南 文山 663099；2.云南省獸醫生物制品研制中心，云南 保山 678000)

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒(Infectionwithclassicalswinefevervirus，簡稱CSFV)引起的一種急性、發熱、接觸性傳染病，具有高度傳染性和致死性。本病在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和野豬都易感，一年四季均可發生，是威脅養豬業的主要傳染病之一[1]。疫苗免疫是豬瘟防控的重要策略之一。

豬瘟病毒屬黃病毒科豬瘟病毒屬，是一種RNA病毒。豬瘟因與高致病性豬藍耳病等疾病在臨床上表現得非常相似，使鑒別診斷難度增大。為了能快速、準確診斷豬瘟病毒，結合文山州基層獸醫實驗室的檢測水平，運用國內較為成熟的PCR技術，建立了CSFV套式PCR檢測方法，為快速診斷與預防豬瘟提供重要技術手段。

1 材料與方法

1.1 病毒和樣品

1.1.1病毒

CSFV陽性樣本、PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)陽性樣本和PCV(豬圓環病毒)陽性樣本均由云南省動物疫病預防控制中心惠贈，貯存于文山州動物疫病預防控制中心PCR實驗室-79 ℃超低溫冰箱。

1.1.2樣品

發病豬病死后病理解剖時以出血性病變為主，全身淋巴結腫脹，扁桃體、脾臟、淋巴結有出血點。

采集發病豬和健康豬的扁桃體、脾臟和淋巴結3個部位，采集文山州8個縣(市)大型規模養殖場疑似豬瘟病料共10份，貯存于文山州動物疫病預防控制中心PCR實驗室-79 ℃獨立冰箱。

1.2 主要試劑

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒、95%無水乙醇、異丙醇、冰乙酸、西班牙瓊脂糖、TAE電泳緩沖液、1×PBS液、TaKaRa PrimeScriptTMOne-Step RT-PCR試劑盒、TaKaRa Premix Taq Enzyme、TaKaRa Marker DL-1000或DL-2000。

豬瘟病毒引物由云南省動物疫病預防控制中心惠贈(參照GB/T 36875—2018)。見表1。

表1 豬瘟病毒套式RT-PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1樣品的制備

將發病豬和健康豬的扁桃體、脾臟、淋巴結等病料研磨后，用0.85%生理鹽水稀釋，10000r/min，離心2～3min后收集上清液，備用。

1.3.2檢測樣品總RNA的提取

采用AxyPrep病毒DNA/RNA試劑盒提取。

1.3.3實驗室CSFV套式PCR擴增

以獲得的總RNA為模板進行第一輪一步法擴增。反應體系(50μL)：2×1 Step Buffer 20μL，PrimeScriptTMOne Step Enzyme Mix 1.5μL，外套上下游引物各1μL，RNA模板1.5μL，用RNase-free Water補至50μL。反應擴增程序為：50℃反轉錄30min，94℃預變性2min；95℃變性15s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min。

以第一輪擴增后的PCR產物為模板進行第二輪PCR擴增。反應體系(50μL)：Premix Taq Enzyme 25μL，內套上下游引物各1μL，第一輪PCR產物1.5μL，用RNase-free Water補至50μL。反應擴增程序為：94℃預變性2min；95℃變性15s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min。取10μL第二輪PCR產物進行1%瓊脂糖電泳后，凝膠成像系統中照像觀察。

2 結果

2.1 CSFV套式PCR檢測方法特異性實驗

用所建立的方法對CSFV、PRRSV和PCV陽性樣本進行擴增，結果只有CSFV陽性樣本擴增出272bp的目的條帶，與預期條帶大小一致，陰、陽性對照均成立，說明所建立的方法是特異的(見圖1)。

2.2 樣品中CSFV的檢測

用所建立的方法對發病豬和健康豬的扁桃體、脾臟和淋巴結的核酸進行擴增，結果只有發病豬的扁桃體、脾臟和淋巴結擴增出272bp的目的條帶，與預期條帶大小一致，陰、陽性對照均成立，說明所建立的方法成立(見圖2)。

M.DL-2000 DNA Marker；1.陽性對照；2.陰性對照；3-5.發病豬的扁桃體、脾臟和淋巴結擴增產物；6-8.健康豬的扁桃體、脾臟和淋巴結擴增產物。

2.3 檢測方法的應用

對10份疑似豬瘟病料進行檢測，CSFV陽性4份，陰性6份，擴增結果見圖3。

M.DL-1000 DNA Marker；1.陽性對照；2.陰性對照；3-12.病料擴增產物。

3 討論

豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種急性、高度接觸性的致死性傳染病，因與高致病性豬藍耳病等疾病在臨床上表現得非常相似，一定程度上給獸醫臨床診斷造成很大困難。為此，早期鑒別診斷并及時了解發病狀況對控制豬瘟的流行尤為重要。PCR方法現已經成為動物疫病檢測較為理想的方法，其快速、敏感、特異的優點為動物疫病早期診斷和分子流行病學調查提供了一條新途徑。使用套式PCR(Nest-PCR)是在PCR的基礎上，利用第二套特異性引物擴增第一次反應生成的PCR產物的“亞片段”，可使檢測結果更具有特異性和敏感性。

目前文山州8個縣(市)已有7個獸醫實驗室可開展分子生物學檢測，將該方法運用到獸醫診斷中，大大節約了檢測時間，更好地為養殖戶提供診斷和治療建議，從而減少了豬瘟對養豬業造成的損失。

文山州地處云南省東南部，其南部的馬關、麻栗坡、富寧3縣的15個鄉(鎮)與越南接壤，國境線長達438km，有邊境通道116條，東部的丘北、廣南、富寧3縣的16個鄉(鎮)與廣西、貴州相連，邊界線長675km。若想有效提升防疫工作，防止豬瘟病毒跨境、跨界和本地流行，除了要嚴格疫苗的運輸與儲藏外，還要確保疫苗管理與使用的科學性。基層動物防疫部門除了定期向村獸醫進行業務培訓，做好豬群的豬瘟免疫抗體監測，并及時補免外，還要向養殖戶宣傳嚴禁違規調運、販賣和丟棄病死豬。