馬鈴薯瘡痂病菌分離鑒定與抗病誘導劑對馬鈴薯瘡痂病防治效果研究

張鉉哲，陳 梅，趙 雪，任雪琦，徐浩然，陳蘇慧

（東北農業大學農學院，哈爾濱 150030）

鏈霉菌是土壤腐生菌，具有產生生物活性次級代謝物能力，特別是抗生素以及一些細胞外水解酶和其他化合物。僅有少數鏈霉菌具有植物致病性，引起馬鈴薯、蘿卜、胡蘿卜、甜菜和甘薯等多種作物根部病害[1-2]。

馬鈴薯瘡痂病（Potato common scab，PCS）是由多種植物致病性鏈霉菌引起的一種全球性重要病害。在馬鈴薯生產中除馬鈴薯晚疫病外，PCS降低塊莖品質，導致薯皮粗糙，影響種薯生產、鮮薯銷售和加工[2-3]。Streptomycesscabies、S.acidiscabies和S.turgiscabies被認為是引起馬鈴薯瘡痂病最普遍病原菌[4]。塊莖細胞未木栓化幼嫩皮孔易受感染，所以致病鏈霉菌在馬鈴薯塊莖快速膨大期間易侵入[5]。PCS為土傳病害，由于土壤環境復雜性以及土壤顆粒機械保護作用，為該病害防治增加難度。現階段防治瘡痂病最有效管理策略為種植健康無病抗病品種，并結合化學殺菌劑防治。然而，目前無有效防治瘡痂病化學殺菌劑。由此可見，馬鈴薯瘡痂病防治成為生產和育種過程中亟待解決問題。

抗病誘導劑可誘發植物自身免疫系統，最終使植物獲得抵御病害能力，保護植物免受病原物侵害，也減少化學農藥使用[6]。目前有多種抗病誘導劑用于防治馬鈴薯瘡痂病，龔秀會等研究表明，使用誘抗劑BTH抗病誘導劑對馬鈴薯瘡痂病具有較好防治效果，最佳防效達63.59%[7]。目前水楊酸（Salicylic acid，SA）在馬鈴薯瘡痂病防治上報道較多，湯曉莉等研究表明，施用外源SA增強植株對瘡痂病系統抗性，顯著降低種薯感病率[8]。王宏虬等在結暑期至成熟期定期用SA葉面噴施，結果表明，可有效提高植株對瘡痂病抗性[9]。草酸（Oxalic acid，OA）、β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MJ）分別在誘導植株對黃瓜霜霉病[10]、馬鈴薯晚疫病[11]和辣椒青枯病[12]等病害上應用廣泛，但在馬鈴薯瘡痂病防治上未見報道。為選出對馬鈴薯瘡痂病具有良好誘抗效果抗病誘導劑，本研究采用5種抗病誘導劑對馬鈴薯植株葉面噴霧，誘導馬鈴薯對瘡痂病抗病性，并測定各抗病誘導劑對馬鈴薯產量影響以及對馬鈴薯瘡痂病防治效果，以期為馬鈴薯瘡痂病防治提供新防治依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高氏1號培養基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，KNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Fe?SO4·7H2O 0.01 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2~7.4。用于菌株產孢培養物。

ISP2培養基：酵母提取物4 g，麥芽糖提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2~7.4。用于菌株分離和常規培養。

供試誘抗劑：草酸、水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MJ）、3-氨基丁酸（BABA）、2,1,3-苯并噻二唑（BTH）（化學純），均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，12%中生菌素可濕性粉劑由福建凱立生物制品有限公司提供。

供試馬鈴薯品種：大西洋。

1.2 病樣采集與菌株分離

病原菌采集與分離：2020年馬鈴薯收獲期間，于黑龍江省哈爾濱市采集患瘡痂病薯塊。采用稀釋分離法分離病原菌。首先用清水沖洗病薯并晾干，無菌刀切取病健交界處置于75%酒精內消毒，無菌水漂洗3次。漂洗完畢后，分別置于無菌研缽中加入少量蒸餾水研磨成勻漿，靜置0.5 h使病原菌充分釋放至溶液中。4層無菌紗布過濾，并對濾液稀釋為10-1、10-2、10-3，分別吸取稀釋液30μL涂布于ISP2培養基平板上。涂板之前將均質樣品55℃熱處理3 min以抑制增長迅速細菌。7 d后，選擇白色粉狀單菌落，采用劃線法純化3次，將純化后菌株編號，于4℃冰箱保存備用。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株致病性鑒定

參照Loria等方法[13]，鏈霉菌屬用馬鈴薯塊莖切片法評價瘡痂病感病品種大西洋致病性。塊莖用0.5%NaOCl消毒后切成塊莖盤（直徑1.5 cm，厚度3 mm），置于培養皿中潤濕無菌濾紙。在28℃條件下，將菌株在高氏1號培養基上培養7 d。將產孢菌落打成7 mm菌餅，將菌餅含菌一側緊貼于塊莖盤上。每個處理3次重復，接種未接菌瓊脂塊為空白對照。28℃條件下黑暗培養7 d后，檢測所有塊莖切片，觀察并統計馬鈴薯切片是否變褐，若變褐則該菌即具有致病性。

1.3.2 致病菌形態觀察和生物學特性測定

菌株形態觀察：在ISP2培養基上觀察菌落形態特征和色素顏色。用蓋玻片輕壓長滿孢子鏈霉菌菌落，并用光學顯微鏡觀察菌絲及孢子鏈形態，根據病原菌形態特征，鑒定病原菌。鑒定標準參照《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》[14]。

生物學特性測定：菌株碳源、氮源、H2S、纖維素分解、黑色素產生等生物學特性測定參照《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》[14]。

1.3.3 致病菌分子鑒定

基因組DNA提取：采用劉炳輝等方法中優化SDS法提取DNA[15]。

序列PCR擴增及同源性分析：鏈霉菌16SrD?NA通用引物序列為：PrimerA：5'CATTCACGGAG AGTTTGATCC 3'，PrimerB：5'AGAAAGGAGGTG ATCCAGCC 3'。擴增條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s，運行30個循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將PCR產物送至上海生工測序。對所得序列于NCBI作Blast比對，利用MEGA 7.0軟件作多序列比對，并構建系統發育進化樹。

1.4 抗病誘導劑對馬鈴薯瘡痂病防治效果

1.4.1 抗病誘導劑對病原菌離體作用

將菌株于高氏1號培養基上避光培養7d，用少量無菌水洗下病菌孢子，分裝至離心管中5000r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入無菌水將孢子濃度調節至108CFU·mL-1，4℃保存備用。

用無菌水將草酸、BABA、BTH、SA和MJ分別配制成5、10、20、50和100μg·mL-15個濃度，以清水處理為空白對照。采用紙碟法，將配置好菌懸液取100μL均勻涂布于瓊脂平板上，將圓形濾紙片（d=0.6 cm）分別用上述濃度誘導劑浸濕，置于瓊脂平板中央，每個濃度重復3次，28℃條件下暗培養7 d，觀察是否形成抑菌圈。

1.4.2 抗病誘導劑田間試驗

試驗于2019年在東北農業大學校內實驗站開展，播種地前茬作物為馬鈴薯，且馬鈴薯瘡痂病發生嚴重。試驗采用隨機區組設計，共設計7個處理，每小區面積為18 m（23 m×6 m），各處理3次重復。采用壟作方法種植，各小區常規除草、中耕和施肥。精選健康無病且均勻一致馬鈴薯種薯，0.5%NaClO浸泡3 min表面消毒后，無菌水清洗晾干，再用10 mg·L-1赤霉素溶液浸泡30 min，將塊莖置于室內保溫催芽。出芽后然后將塊莖切成含2~3個芽眼薯塊，置于室內通風處2 d后播種。

5種抗病誘導劑施用濃度為50μg·mL-1，以殺菌劑12%中生菌素400μg·mL-1為藥劑對照，以施用清水為空白對照。田間馬鈴薯出苗25 d后開始使用藥劑，將抗病誘導劑均勻噴施到馬鈴薯植株葉面上，噴施程度為葉片無液滴滴落為止。中生菌素模擬灌溉處理，每株200 mL，每隔7 d施用1次，共施用4次。最后1次施用藥劑間隔7 d后，各小區采用5點取樣法，每個采樣點選取4株馬鈴薯，每小區共采集20株。調查測定各處理馬鈴薯產量，包括大中薯質量（大中薯≥50 g）、小薯質量（<50 g），計算發病率、病情指數和防治效果。

薯塊瘡痂病分級標準：0級：薯皮健康，無病斑；Ⅰ級：薯皮基本健康，所占面積未超薯皮表面積1/4；Ⅱ級：所占面積為薯皮表面積1/4~1/3；Ⅲ級：所占面積占薯皮面積1/3~1/2；Ⅳ級：嚴重感病，病斑面積超過薯皮表面積1/2。

發病率（%）=每小區發病種薯粒數/每小區收獲種薯粒數×100；

病情指數（%）=∑（各級病薯數×該病級代表值）（/調查總薯塊數×最高級值）×100；

相對防治效果（%）=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100。

1.4.3 數據統計分析

采用DPS7.05軟件，應用Duncan氏新復極差法，分析試驗數據差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯瘡痂病癥狀及病原菌分離鑒定

2.1.1 馬鈴薯瘡痂病癥狀

從馬鈴薯田采集患病薯塊癥狀表現為：馬鈴薯塊莖表皮形成瘡痂病斑，發病部位為木栓化褐色病斑，病斑產生裂痕，病斑形狀不規則，呈點狀或連片分布，使塊莖表面變得粗糙且凹凸不平，塊莖發病癥狀如圖1A所示。

2.1.2 菌株致病性測定

將測試菌株菌餅接種至小薯片上，7 d后觀察測試菌株在小薯片上生長情況，且小薯片表面均產生褐色壞死，對照未產生褐變現象。經測定，14株鏈霉菌中共獲得致病菌株9株，致病菌占比為64.3%，各菌株接種小薯片發病率均為100%，菌株致病癥狀如圖1B、C所示。

2.1.3 菌株分離和形態觀察

觀察致病菌株形態得出，各致病菌株在ISP2培養基平板上宏觀和顯微形態相同，均為菌落灰色，表面粗糙，邊緣不規則，菌落上方形成褶狀隆起，孢子灰色，孢子鏈直鏈狀（見圖2）。

圖1 馬鈴薯瘡痂病癥狀圖及鏈霉菌致病癥狀Fig.1 Symptom of potato common scab and pathogenicity of isolates of Streptomyces spp.

圖2 鏈霉菌形態觀察Fig.2 Morphological observation of Streptomyces

2.1.4 馬鈴薯瘡痂病菌生物學特性測定

挑選代表性菌株HRB-20-9測定生物學特性，結果表明，該菌株以組氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸、羥脯氨酸為單一氮源，以甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、肌醇為單一碳源，對20μg·mL-1鏈霉素、0.1%苯酚、0.5μg·mL-1結晶紫敏感，對10 IU·mL-1青霉素不敏感，在特定培養基中產生黑色素和H2S，產生淀粉酶使淀粉水解，符合S.scabies生理生化特征（見表1）。

2.1.5 致病菌株分子鑒定

采用16SrDNA引物作PCR擴增測序，在NCBI中作Blast比對，選取與測試菌株相似性較高序列和鏈霉菌典型菌株，利用MEGA 7.0作序列比對和構建系統發育樹，結果表明，HRB-20-9與S.scabies同源性較高（見圖3）。結合生物學特性將該菌株鑒定為S.scabies。

2.2 抗病誘導劑對致病鏈霉菌離體作用

通過紙碟法測定5、10、20、50、100μg·mL-1誘導劑對馬鈴薯瘡痂病菌HRB-20-9離體作用，結果表明，不同濃度抗病誘導劑對致病鏈霉菌均未出現抑菌圈（見圖4），說明抗病誘導劑對病原菌無直接殺滅作用。

表1 馬鈴薯瘡痂病菌生物學特性Table 1 Characteristics of potato common scab strains

圖3 HRB-20-9菌株16Sr DNA序列系統發育樹Fig.3 16Sr DNA sequencephylogenetic tree of HRB-20-9 strain

2.3 抗病誘導劑對馬鈴薯產量的影響

田間對各抗病誘導劑和殺菌劑對馬鈴薯產量影響結果測定結果表明（見表2），產量為38 220~39 975 kg·hm-2內波動，各處理間無顯著差異，說明5種誘導劑均對鈴薯產量無影響。

2.4 抗病誘導劑對馬鈴薯瘡痂病防治效果

抗病誘導劑和殺菌劑對馬鈴薯瘡痂病防治效果調查結果表明，各抗病誘導劑及中生菌素對馬鈴薯瘡痂病均有一定防治效果（見表3），可減少瘡痂病發病率，其中MJ處理發病率最低，為82.4%，與清水對照相比降低17.6%。與使用殺菌劑中生菌素相比，SA和MJ防治效果菌顯著高于中生菌素，其中MJ防治效果最佳，防效達43.6%。其次是SA，防效為38.1%，而草酸和BABA防效相對較差，顯著低于中生菌素，防效僅為23.7%和20.6%。

圖4 抗病誘導劑對HRB-20-9離體抑制作用Fig.4 Effects of different concentrations of disease resistant inducers on HRB-20-9 in vitro

表2 噴施不同誘導劑對馬鈴薯產量的影響Table 2 Effect of different inducers on potato yield

表3 噴施不同抗病誘導劑對馬鈴薯瘡痂病防治效果Table3 Control effect of spraying different diseaseresistanceinducerson potato common scab

3 討論與結論

馬鈴薯瘡痂病是一種嚴重土傳病害，致病菌由多種鏈霉菌組成，且不同地區致病菌分布存在差異。目前甘肅報道的病原菌有瘡痂鏈霉菌（S.scabies）、灰色鏈霉菌（S.griseus）、鮑比氏鏈霉菌（S.bobili）和加利利鏈霉菌（S.galilaeus）[16-17]，河北地區致病菌有瘡痂鏈霉菌（S.scabies）、歐洲瘡痂鏈霉菌（S.europaeiscabiei）和淀粉酶產色鏈霉菌（S.diastatochromogenes）[18]，黑龍江哈爾濱市目前報道病原菌種有酸性瘡痂鏈霉菌（S.acidiscabies）和腫痂鏈霉菌（S.turgidiscabies）[19]。但未見S.scabies菌株報道。本研究從哈爾濱市采集具有典型瘡痂病癥狀馬鈴薯病斑上分離得到14株鏈霉菌，通過小薯片法測定發現9株（64.3%）具有致病性。根據16S rDNA序列構建系統發育樹并結合形態學觀察、生物學特性測定將致病菌株鑒定為S.scabies，說明哈爾濱地區馬鈴薯瘡痂病致病菌有S.scabies。

采用紙碟法分別檢測草酸、SA、BABA、BTH、MJ對致病鏈霉菌生長影響。離體條件下不同濃度抗病誘導劑對病原菌未形成抑菌圈，說明誘抗劑對馬鈴薯致病鏈霉菌無毒殺作用，對馬鈴薯瘡痂病產生防治效果是其誘導馬鈴薯植株產生抗病性結果。田間試驗中，使用5種抗病誘導劑對馬鈴薯植株葉面噴施，研究表明不同誘導劑處理對馬鈴薯產量無顯著影響，瘡痂病菌僅侵染馬鈴薯表皮層，并未造成馬鈴薯產量下降，也有研究表明，在瘡痂病發病嚴重時，引起馬鈴薯產量降低[20]。誘導劑使用均降低馬鈴薯瘡痂病發病率，并取得一定防治效果，其中MJ防治效果最佳，發病率與清水對照相比降低17.6%，防效高于中生菌素對照藥劑，達43.6%。說明抗病誘導劑誘導馬鈴薯植株對瘡痂病抗性，從而產生抵抗病原菌能力，降低發病率，提高馬鈴薯品質。目前，OA、MJ和BABA在馬鈴薯瘡痂病防治研究中未見報道。已有報道用于防治馬鈴薯瘡痂病抗病誘導劑有SA和BTH。楊鑫等使用不同抗病誘導劑對馬鈴薯液面噴霧，結果表明不同誘導劑均降低瘡痂病發病率，其中SA防治效果達到43.98%[21]。湯曉莉等研究表明使用外源SA防治馬鈴薯瘡痂病，使馬鈴薯植株矮化，增強植株抗性，有效降低種薯感病率[8]。施用不同濃度誘抗劑BTH處理馬鈴薯植株，降低馬鈴薯瘡痂病發病率和病情指數，濃度為1.00 mmol·L-1時，對瘡痂病相對防效高達63.59%[7]。而本研究中BTH防效較低，因此推斷其可能是由于使用劑量較低導致，其他使用劑量有待進一步測定。王宏虬等開展馬鈴薯瘡痂病最適誘導劑篩選試驗，最適抗病誘導劑為SA，其防效顯著高于BTH，這一趨勢與本研究結果一致[9]。

抗病誘導劑誘導植物自身對外來病原物產生免疫反應，這類物質在較低濃度下即被植物識別，誘導植物產生抗性，從而抵御外來病原物侵染[22]。使用抗病誘導劑防治植物病害具有使用方便、有效、安全，對環境無副作用等特點[23]。因此抗病誘導劑可作為一種植物生長調節劑和誘抗劑應用于農業生產，有利于農作物生長發育，降低植物病害發生率，減少化學農藥使用量，提升農產品產量和品質。本研究所選用5種抗病誘導劑中，MJ噴施馬鈴薯葉片防治效果最佳，可作為馬鈴薯瘡痂病最適誘抗劑，但本研究僅使用一個濃度，MJ使用最佳濃度還有待進一步研究。目前抗病誘導劑在馬鈴薯瘡痂病防治上的應用較少，在后續研究中可將誘導劑與化學殺菌劑混合使用，并結合使用抗性品種，以期為馬鈴薯瘡痂病防治提供更有效防治措施。