香菇多糖對(duì)奶牛乳房炎常見病原菌體外抑菌作用的研究

雷莉輝，關(guān)文怡，孫 健，蔡澤川

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442）

香菇多糖（lentinan, LNT）是真菌多糖中應(yīng)用較多的多糖之一。因其具有增強(qiáng)機(jī)體對(duì)多種細(xì)菌、病毒、寄生蟲感染的免疫能力等生物活性在臨床應(yīng)用中日益受到重視[1]。有試驗(yàn)研究表明，香菇多糖對(duì)機(jī)體中體液免疫有一定的增強(qiáng)作用，它能提高機(jī)體中淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，使白細(xì)胞數(shù)量升高，促進(jìn)免疫球蛋白IgG的形成[2]。有研究表明，多糖在體外也能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。但多糖對(duì)各類微生物抑菌作用的機(jī)制還不十分明確[3-4]。

本研究擬通過香菇多糖對(duì)引起某奶牛場(chǎng)乳房炎的主要病原菌的體外抑制作用的研究，為香菇多糖作為抑菌成分的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，從而進(jìn)一步促進(jìn)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 從奶牛乳房炎病例中分離、純化、鑒定得到的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中各選取1株。

1.1.2 藥物香菇多糖 購(gòu)自西安巖昊生物科技有限公司，批號(hào)20180410。

1.1.3 營(yíng)養(yǎng)基及其配制 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏1 g、酵母膏2 g、蛋白胨5 g、NaCL 5 g、瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 ml，調(diào)pH為7.4。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，加蒸餾水定容至1 000 ml，調(diào)pH為7.4，蒸餾水。

1.1.4 試驗(yàn)儀器及設(shè)備 電熱爐、電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱、生物安全柜、高壓蒸汽滅菌器、游標(biāo)卡尺、微量移液器、EP管、錐形瓶、培養(yǎng)皿（直徑9 mm）、接種環(huán)、三角涂布器、濾紙等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 （1）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備。將除瓊脂外的各成分溶解于蒸餾水中，充分?jǐn)嚢璨⒕徛訜嶂蠓兄镣耆芙猓Ｕ齪H后加入瓊脂，分裝至三角瓶，121°C高壓滅菌15min，冷卻后分裝至培養(yǎng)皿，無(wú)菌檢驗(yàn)后冷藏于4 ℃ 備用。（2）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的制備。將各成分溶解于蒸餾水中，攪拌并加熱煮沸至完全溶解，分裝于試管中，121 ℃ 高壓滅菌15 min，無(wú)菌檢驗(yàn)后冷藏于4 ℃ 備用。

1.2.2 香菇多糖溶液的準(zhǔn)備 稱取一定量的香菇多糖溶于高壓蒸汽滅菌水中，旋渦振蕩混勻，再浸泡約6 h后，配成300mg/L的溶液，先用4層紗布進(jìn)行過濾，再用0.45 μm微孔濾膜過濾后分裝。

1.2.3 細(xì)菌懸液的制備 把各試驗(yàn)菌種（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）先接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h，使菌種復(fù)壯，然 后挑取1個(gè)特征性菌落接種于10 ml的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h，從該培養(yǎng)液中移取100 μl加到10 ml的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h，將肉湯中擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)菌用已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯配制成含活菌數(shù)約106個(gè)/ml的細(xì)菌懸液，待用。

1.2.4 香菇多糖的體外抑菌試驗(yàn) 利用平板擴(kuò)散法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。取稀釋后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌懸液各200 μl，分別用三角玻璃涂布器均勻涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面（每種菌做3個(gè)平皿），然后在每個(gè)平皿上用直徑6 mm的打孔器按等邊三角形的圖案打孔，用9號(hào)注射器針頭挑取孔內(nèi)的瓊脂，形成加樣孔，注意每孔之間間距相等且不小于20 mm。再將該平板于酒精燈火焰上略微加熱，使打孔后的瓊脂底部與平皿再次緊密貼合，防止加入的藥液從底部的縫隙串孔。將制備好的香菇多糖溶液用微量移液器分別加入接種有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的瓊脂平板中，其中兩孔加香菇多糖溶液作為平行樣，另一孔加滅菌生理鹽水作為對(duì)照。每孔以加滿但不溢出為準(zhǔn)，且每個(gè)平皿上的3個(gè)孔加樣量基本保持一致。37 ℃ 培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑大小。

1.2.5 香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的體外最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 用倍比稀釋法將300mg/L的香菇多糖溶液稀釋成濃度為150、75、37.5、18.75、9.375mg/L 5個(gè)濃度梯度，按上述1.2.4中的方法，每個(gè)菌種做6個(gè)平皿，在每個(gè)平皿上打5個(gè)加樣孔，分別加入5個(gè)濃度梯度的香菇多糖溶液。測(cè)量并記錄結(jié)果，取其平均值，以出現(xiàn)抑菌圈的最低濃度為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外抑菌效果

通過平板打孔法測(cè)定香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的體外抑菌效果，結(jié)果見表1。

表1 香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的 抑菌圈平均直徑 （mm）

由表1可知，香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌這2種引起奶牛乳房炎的主要病原菌均有一定的體外抑菌效果，且對(duì)大腸桿菌的抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。

2.2 香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的體外最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果

香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的體外最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 香菇多糖的體外最低抑菌（MIC）濃度試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，香菇多糖的抑菌效果隨濃度的降低而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為37.5mg/L，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為18.75mg/L。

3 討論

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，可初步證明香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的體外抑制作用，對(duì)大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱；香菇多糖對(duì)同一種病原菌的抑制作用與香菇多糖的濃度呈正相關(guān)，濃度越高，抑菌效果越明顯，香菇多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為37.5mg/L，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為18.75mg/L。

目前已報(bào)道的可引起奶牛乳房炎的病原微生物至少有150種，主要為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌等[5]。隨著抗生物在乳房炎治療過程中的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，迫切需要有生物活性作用且不產(chǎn)生耐藥性的生物活性物質(zhì)應(yīng)用于乳房炎的臨床治療。本試驗(yàn)為香菇多糖對(duì)細(xì)菌的體外抑菌活性研究，在大多數(shù)報(bào)道中，

體內(nèi)抑制試驗(yàn)效果好于體外抑制實(shí)驗(yàn)[6]。本研究證實(shí)香菇多糖對(duì)引起奶牛乳房炎的兩種主要病原菌有明顯的體外抑菌效果，若將香菇多糖添加于奶牛的飼料或飲水中，其抑菌效果將能更好地發(fā)揮，同時(shí)也為香菇多糖應(yīng)用于奶牛乳房炎的治療提供了理論依據(jù)。在后續(xù)的研究中，筆者將對(duì)香菇多糖在奶牛養(yǎng)殖過程中的添加劑量進(jìn)行進(jìn)一步的探索。