玉米轉(zhuǎn)錄因子NAC78的克隆及表達(dá)特性分析

何姍 王智康 楊陽 牟玥薇 黃玉碧 余國武

（作物科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)示范中心 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

NAC（NAM，ATAF1/2，CUC2）是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，NAC的命名由最早發(fā)現(xiàn)的矮牽牛（Petunia hybrida Vilm.）NAM基因、擬南芥ATAF1/2基因和CUC1/2基因首字母組成［1-3］。NAC蛋白的N端含有一段與NAM蛋白高度同源的保守氨基酸序列，被稱為NAC結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域起著結(jié)合DNA或蛋白的功能。不同NAC蛋白的C端則表現(xiàn)出高度的變異［4］。目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了超過110個的NAC蛋白，在水稻中發(fā)現(xiàn)了超過150個，在玉米中發(fā)現(xiàn)了超過130個［5-7］。這些NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了植物生長發(fā)育、環(huán)境脅迫以及激素信號傳導(dǎo)等多種生命活動［8-10］。

NAC蛋白廣泛存在于陸地植物中，但近年來也在水生的綠藻中發(fā)現(xiàn)了NAC蛋白，意味著在陸地植物出現(xiàn)前，NAC蛋白已經(jīng)出現(xiàn)并發(fā)揮作用［11］。陸生植物與水生植物的最大區(qū)別之一在于，陸生植物進(jìn)化出了專門用于水分傳導(dǎo)和儲存的細(xì)胞，許多NAC蛋白調(diào)控植物篩管和導(dǎo)管分子的形成，對保障陸生植物正常水分供需極其重要［12-13］。苔蘚PpVNS家族蛋白功能缺失突變體的導(dǎo)水細(xì)胞發(fā)育異常、孢子畸形，嚴(yán)重阻礙了植物的正常發(fā)育和繁衍，而在苔蘚和擬南芥中過表達(dá)PpVNS促進(jìn)了導(dǎo)水細(xì)胞的分化。且PpVNS在苔蘚和擬南芥中調(diào)控相似的基因網(wǎng)絡(luò)，這一基因在不同的物種中功能保守性高，意味著NAC轉(zhuǎn)錄因子可能參與了植物對陸地適應(yīng)過程中導(dǎo)水細(xì)胞和支持細(xì)胞的進(jìn)化［14］。不僅如此，植物在復(fù)雜的陸地自然環(huán)境中，常常遭遇高溫、干旱等非生物脅迫的挑戰(zhàn)，研究發(fā)現(xiàn)25%以上的NAC蛋白至少參與了植物對一種脅迫的響應(yīng)［15］。白楊BpNAC012能夠?qū)χ参锏拇紊谛纬杉胺巧锩{迫響應(yīng)起到積極的作用，過表達(dá)BpNAC012的植株次生壁明顯增厚，對鹽脅迫和滲透脅迫的抵抗能力明顯增強(qiáng)［16］。水稻 SNAC1（stress-responsive NAC1）的過表達(dá)使得水稻表現(xiàn)出明顯的抗旱性和耐鹽性，并且能顯著提高過表達(dá)植株的產(chǎn)量，在作物育種方面具有重要的意義［17］。另外，一些NAC蛋白表現(xiàn)出對生物脅迫和非生物脅迫的雙重功能。棉花GhATAF1的過表達(dá)激活了包括ABA的應(yīng)答基因GhABI4在內(nèi)的多個脅迫響應(yīng)基因，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對鹽的耐受性，但過表達(dá)植株對黃萎病病毒（Verticillium dahliae Kleb.）和灰酶（Botrytis cinerea）更加敏感，同時抑制了茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［18］。由此可見，NAC蛋白對逆境的響應(yīng)可能是影響多種激素信號網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用的結(jié)果。

脫落酸（abscisic acid，ABA）在植物的多種發(fā)育過程中和環(huán)境脅迫響應(yīng)中起著重要作用。模式植物擬南芥中有將近10%的編碼蛋白質(zhì)的基因受到ABA的調(diào)節(jié)，遠(yuǎn)高于其他的植物激素［19-20］。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多NAC蛋白能夠響應(yīng)ABA，如玉米ZmNAC071能抑制脅迫響應(yīng)基因表達(dá)進(jìn)而使得過表達(dá)擬南芥對ABA和滲透脅迫的敏感性增強(qiáng)［21］。ZmNAC84的表達(dá)受到H2O2的誘導(dǎo)，通過響應(yīng)H2O2信號參與到ABA誘導(dǎo)的抗氧化防御進(jìn)程，過表達(dá)ZmNAC84的煙草株系具有更強(qiáng)的抗旱能力，并且在干旱條件下具有更少的氧化損傷［22］。水稻OsNAC2通過結(jié)合非生物脅迫和ABA響應(yīng)通路的標(biāo)記基因OsLEA3（LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT 3）和 OsSAPK1（Stress-Activated Protein Kinases 1）基因的啟動子，同時調(diào)節(jié)非生物脅迫反應(yīng)和ABA介導(dǎo)的反應(yīng)，并在ABA和非生物脅迫途徑之間起作用［23］。

玉米是第三大糧食作物，是食物和工業(yè)原料的重要來源，玉米灌漿期遭受干旱或鹽脅迫將導(dǎo)致產(chǎn)量下降［24-26］。而ABA對于玉米籽粒發(fā)育的影響更為復(fù)雜，施用外源ABA對產(chǎn)量的影響與施用的時間和劑量有關(guān)［27］。本研究對授粉后20 d的Mo17玉米胚乳蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，篩選得到了一個表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)錄因子NAC78，通過克隆了NAC78的開放閱讀框（ORF），并通過熒光定量PCR技術(shù)對NAC78的組織表達(dá)特性和對ABA、NaCl、PEG的響應(yīng)進(jìn)行了分析，為深入研究NAC78在玉米對非生物脅迫的響應(yīng)和玉米胚乳發(fā)育過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)使用的植物材料為玉米骨干自交系Mo17，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，取Mo17的根、莖、葉、花絲、花藥、授粉后15 d玉米棒中部的籽粒、胚及授粉后5-30 d胚乳用液氮迅速冷凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ∽越皇诜酆?5 d的玉米棒中部籽粒置于含有50 μmol/L ABA的液體MS培養(yǎng)基中緩慢震蕩（50 r/min）培養(yǎng)48 h，同時以在不含有ABA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的籽粒作為對照，每12 h取出部分籽粒用液氮迅速冷凍并保存?zhèn)溆谩Ｔ谂囵B(yǎng)室中種植Mo17玉米，待植株長至三葉期時選取長勢旺盛，生長狀態(tài)一致的玉米苗澆灌NaCl（200 mmol/L）和PEG（25%）進(jìn)行脅迫處理，處理后0 h，1 h、6 h、12 h和24 h，取相同部位葉片用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）購自寶生物生物技術(shù)（北京）有限公司。

本試驗(yàn)中使用的總RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、重組克隆試劑盒、高保真DNA聚合酶購自南京諾維贊生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒載體pMD19-T、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ、SYBR染料購自寶生物生物技術(shù)（北京）有限公司。引物（表1）合成及測序由成都擎科梓熙科技技術(shù)有限公司完成。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 NAC78的克隆 提取授粉后15 d的Mo17胚乳總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳回收后連接克隆載體pMD19-T，提取陽性克隆的質(zhì)粒并測序驗(yàn)證序列是否為目的序列。

1.2.2 NAC78的生物信息學(xué)分析 使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分 析 NAC78的結(jié)構(gòu)域；利用Prot Scale程序（https：//expasy.org/cgibin/protscale.pl）分析蛋白質(zhì)疏水性；利用Prot-Param分析蛋白的理化性質(zhì)；利用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預(yù)測NAC78的三維結(jié)構(gòu)；用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹；用 ESPript3.0（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgibin/ESPript.cgi）進(jìn)行氨基酸序列的多重比對；利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測啟動子的順式作用元件。

1.2.3 NAC78的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析 實(shí)時熒光定量儀器為伯樂CFX96。依照SYBR Green PCR Master Mix說明書加入試劑、模版、引物和ddH2O。運(yùn)行條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s；55℃退火15 s；72℃延伸10 s；此過程45個循環(huán)，每個樣品設(shè)置3個平行重復(fù)。以玉米Actin基因作為內(nèi)參，試驗(yàn)均進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 NAC78基因的克隆

提取Mo17的胚乳總RNA，以Mo17自交授粉后15 d的玉米胚乳cDNA作為模版，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到約1 800 bp的片段，挑取陽性克隆測序后得到NAC78開放閱讀框的核苷酸序列。測序得到的NAC78核苷酸序列長度為1 830 bp，編碼609個氨基酸，預(yù)測蛋白的分子量為67.45 kD，等電點(diǎn)為5.19，為親水性蛋白（圖1-A）。預(yù)測NAC78蛋白氨基酸序列7-133位氨基酸序列為NAM結(jié)構(gòu)域（圖1-B），這一結(jié)構(gòu)域起著結(jié)合DNA的作用。使用Phyre2對NAC78蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測模型N端為α螺旋環(huán)繞平行的β片層構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)，C端為無序結(jié)構(gòu)（圖1-C）。多序列比對結(jié)果顯示，玉米NAC78與其在水稻、高粱、擬南芥等植物中的同源基因相比，蛋白的N端是高度保守的，由8個α螺旋和7個β片層構(gòu)成，分為A-E 5個亞結(jié)構(gòu)域（圖2）。選取擬南芥、水稻、普通小麥、馬鈴薯、番茄、煙草等17種植物中NAC78的同源序基因的氨基酸序列，通過鄰接法（1 000 bootstrap）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示，玉米與谷子、高粱、水稻、普通小麥、香蕉聚為一支，它們均屬于禾本科單子葉植物，親緣關(guān)系較近，且玉米NAC78與谷子NAC86的親緣關(guān)系最為接近（圖3）。

2.2 NAC78組織表達(dá)模式分析

為了解NAC78的表達(dá)模式，本試驗(yàn)提取了玉米不同組織的RNA，通過熒光定量PCR技術(shù)探究了NAC78在Mo17玉米的根、莖、葉、花絲、花藥、胚、胚乳、籽粒及自花授粉后5-30 d的胚乳中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，NAC78在玉米各個組織均有表達(dá)，自交授粉后15 d胚乳中的表達(dá)量顯著高于其他的組織。由于NAC78在胚乳中的表達(dá)量最高，因此本試驗(yàn)檢測了發(fā)育不同時期胚乳中NAC78的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，NAC78的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，授粉后15 d的相對表達(dá)量較第5天增加52.52倍（圖4）。Chen等［28］的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示在授粉后6-28 d NAC78相對表達(dá)量的變化情況也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。由此推測NAC78在胚乳的發(fā)育過程中起著重要作用。

圖1 NAC78蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of NAC78 protein

2.3 NAC78對非生物脅迫的響應(yīng)

根據(jù)Maize GDB數(shù)據(jù)庫中的信息，對NAC78翻譯起始位點(diǎn)ATG上游1 500 bp的啟動子序列進(jìn)行了順式作用元件的預(yù)測和分析。預(yù)測結(jié)果顯示，NAC78基因上游多個光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（表2）。預(yù)測結(jié)果中含有7個ARBE類響應(yīng)ABA的順式元件，因此本試驗(yàn)使用50 μmol/L ABA處理Mo17自花授粉后15 d的玉米籽粒，檢測處理不同時間的玉米籽粒中NAC78的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。結(jié)果顯示，NAC78的表達(dá)受到ABA的誘導(dǎo)，其表達(dá)水平在ABA處理后顯著升高，在ABA處理籽粒6 h后相對表達(dá)量較0 h增加了11.4倍（圖5）。ABA與植物對逆境脅迫的響應(yīng)有密切聯(lián)系，為探究NAC78是否與逆境響應(yīng)相關(guān)，對三葉期幼苗進(jìn)行NaCl和PEG處理，熒光定量結(jié)果表明，NAC78的表達(dá)受到NaCl與PEG的誘導(dǎo)，相對表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，NaCl和PEG處理植株6 h后在葉片中的相對表達(dá)量分別增加了1.87和2.69倍（圖6）。

3 討論

本試驗(yàn)從Mo17玉米胚乳中克隆得到了NAC78基因，其N端具有的典型的NAM結(jié)構(gòu)域，屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族。Phyre2三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示NAC78的N端結(jié)構(gòu)是由α螺旋環(huán)繞反向平行的β片層構(gòu)成的，與ANAC019蛋白N端的結(jié)構(gòu)相類似，推測NAC78的N端與ANAC019等許多NAC轉(zhuǎn)錄因子N端的功能相似，能夠識別結(jié)合特定的靶基因序列、結(jié)合互作蛋白，但還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明［29］。多序列比對的結(jié)果表明，選取的20種植物中的NAC蛋白N端高度保守，推測這些轉(zhuǎn)錄因子可能具有相似的生物學(xué)功能。NAC蛋白的N端含有保守的NAC結(jié)構(gòu)域，典型的NAC結(jié)構(gòu)域又分為A-E 5個亞結(jié)構(gòu)域，不同的亞結(jié)構(gòu)域起著識別、結(jié)合DNA或蛋白質(zhì)的功能，在亞結(jié)構(gòu)域D中含有核定位信號，亞結(jié)構(gòu)域C是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)合位點(diǎn)（WKATGTDK）在不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子中高度保守［30］。而玉米NAC78與其在高粱、谷子、水稻、普通小麥、香蕉、毛果楊、木薯、棉花、馬鈴薯、番茄、煙草、獼猴桃、向日葵、黃瓜、擬南芥中的同源序列相應(yīng)位點(diǎn)為（WKATGKDR），第6和第8位的氨基酸殘基被堿性的賴氨酸（K）和精氨酸（R）替代，由此推測NAC78的靶基因與已知的擬南芥ANAC019等識別的DNA序列不同，或參與了植物中不同的調(diào)控途徑［31］。本試驗(yàn)以各個物種中NAC78同源序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，玉米與谷子、高粱、水稻、普通小麥和香蕉聚為一大支，并且與谷子的親緣關(guān)系最近。Pereira-Santana等［32］基于隱馬爾可夫模型（HMM）鑒定了24種陸生植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和NAC蛋白的分布，本試驗(yàn)得到的結(jié)果與其相似。

圖2 不同物種NAC78同源基因多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of NAC78 homologous genes in different species

圖3 NAC78同源基因的進(jìn)化分析Fig.3 Evolutionary analysis of NAC78 homologous genes

圖4 NAC78在不同組織（A）及授粉后不同時期（B）胚乳中的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of NAC78 in different tissues (A) and endosperm at different stages after pollination (B)

NAC78的表達(dá)具有組織特異性，對NAC78的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況的檢測表明，NAC78在玉米的各個組織中均有表達(dá)，在胚乳中的表達(dá)量顯著高于其他組織，由此可推知NAC78可能在胚乳發(fā)育的過程中起著重要的作用。NAC45/86是NAC78在擬南芥中的同源基因，Kaori等已證明NAC45/86在擬南芥篩管發(fā)育的過程中起著至關(guān)重要的作用，這兩個轉(zhuǎn)錄因子通過對下游基因的調(diào)控使篩管分子的去核化過程正常進(jìn)行［33］。篩管的發(fā)育與胚乳的發(fā)育都是特殊的細(xì)胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）現(xiàn)象，篩管分子在細(xì)胞核降解之后仍然行使運(yùn)輸物質(zhì)的功能［34-35］。同樣，玉米胚乳細(xì)胞核在授粉后15-20 d開始降解，無核的胚乳細(xì)胞仍然具有活性并開始大量積累淀粉蛋白質(zhì)，這一時期也是產(chǎn)量形成的重要階段［36-37］。NAC78在胚乳中的表達(dá)變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，授粉后15 d的相對表達(dá)量較第5天增加52.52倍，據(jù)此推測NAC78可能參與胚乳細(xì)胞PCD過程的調(diào)控，其具體生物的功能有待進(jìn)一步的深入研究。

表2 NAC78啟動子中的順式作用元件Table 2 Cis-elements in the promoter of NAC78

圖5 ABA處理對玉米籽粒中NAC78表達(dá)的影響Fig.5 Effect of ABA treatment on NAC78 expression in maize kernel

ABA是一種重要的植物激素，在植物對逆境脅迫響應(yīng)、生長發(fā)育等多個過程中起著重要的作用。ABA含量的增加能夠誘導(dǎo)多種基因表達(dá)量上調(diào)，施用外源ABA能夠增強(qiáng)植物對與干旱、低溫等多種非生物脅迫的抵抗能力［38］。另外，在對水稻、小麥、玉米的研究中發(fā)現(xiàn)，ABA能夠促進(jìn)籽粒灌漿以及光合同化產(chǎn)物向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使得產(chǎn)量增加［39-40］。前期的研究已發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)ABA信號并調(diào)控植物的生命活動［41］，擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子ABI4、ABI5能夠響應(yīng)ABA信號，進(jìn)而調(diào)控種子的發(fā)育以及淀粉的合成［42-43］。NAC78上游順式作用元件中含有7個AREB類的motif，AREB是響應(yīng)ABA的順式元件。為了探究NAC78的表達(dá)是否受到ABA的誘導(dǎo)，本試驗(yàn)使用ABA對玉米籽粒進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，在ABA處理12 h后，NAC78的表達(dá)水平顯著上升，表明NAC78的表達(dá)受到ABA信號的誘導(dǎo)。后續(xù)的脅迫處理結(jié)果表明NAC78的表達(dá)也受到NaCl和PEG和誘導(dǎo)。自然狀態(tài)下，玉米灌漿期往往處于高溫干旱天氣，在這一條件下玉米需要多種復(fù)雜的機(jī)制調(diào)控自身適應(yīng)環(huán)境脅迫，由本試驗(yàn)結(jié)果可推測，NAC78可能通過參與ABA調(diào)控途徑影響相關(guān)基因的表達(dá)。

圖6 NaCl和PEG處理對葉片中NAC78表達(dá)的影響Fig.6 Effects of NaCl and PEG treatment on NAC78 expression in leaves

4 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆得到了一個新的轉(zhuǎn)錄因子NAC78，具有典型的NAM結(jié)構(gòu)域，屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族。NAC78在胚乳中表達(dá)量顯著高于其他組織，推測其可能參與胚乳發(fā)育過程的調(diào)控。此外，ABA，NaCl和PEG均能夠誘導(dǎo)NAC78的表達(dá)，NAC78可能在玉米響應(yīng)和抵抗非生物脅迫的過程中發(fā)揮作用。