長鏈非編碼RNA TSI抑制TGF-β1介導的乳腺癌細胞MCF-7和BT474轉移

譚梓聰，張洋璠，黃曉燕，楊浩杰，曹銘輝*

乳腺癌是目前全世界發病率最高的惡性腫瘤，其死亡率在世界范圍排名第五位［1］。近年來不少針對乳腺癌治療的研究都把關注點放在乳腺癌的轉移方面，因為乳腺癌的轉移和患者的生存期密切相關，乳腺癌的轉移會加大治療的難度，不利于延長患者的生存期［2，3］。因此，闡明乳腺癌轉移的機制對治療乳腺癌至關重要。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是黏附性的上皮細胞相互分離并轉化為單個遷移性細胞的過程，是腫瘤發生局部侵犯和向遠隔器官播散的關鍵步驟［4，5］。此外，EMT也與腫瘤的耐藥和免疫抑制微環境的維持有關［6，7］。因此，EMT在包括乳腺癌在內的多種腫瘤的進展中起著重要作用［8］。TGF-β1是EMT的主要誘導因子之一，在癌癥進展、遷移、侵襲中發揮關鍵作用，TGF-β信號通路被視為腫瘤EMT進展的關鍵通路之一［9］。已有研究表明TGF-β信號通路在乳腺癌轉移中發揮著重要的作用，與乳腺癌的EMT進展息息相關［10］。除此之外，近年越來越多研究發現細胞內的非編碼RNA能通過TGF-β通路調控細胞EMT過程，從而調控腫瘤細胞的轉移，在乳腺癌中也有相關報道［11，12］。

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）是指長度大于200 nt、參與多種生物學功能的不編碼蛋白質的RNA分子［13，14］。LncRNAs能通過多種手段發揮生物學功能，例如，lncRNA LETN與NPM1蛋白直接結合在核仁里調控細胞增殖，Linc-SCRG1能作為microRNA miR26a的ceRNA加快腫瘤增殖，LINC00665甚至能編碼肽段來影響三陰乳腺癌的進展［15-17］。Lnc-TSI在腎癌和腎臟纖維化中被報道TGF-β信號通路密切相關，在TGF-β信號通路介導的腎癌轉移中發揮重要作用，但是Lnc-TSI在乳腺癌中的作用尚未被報道［18，19］。

本研究著重探討了Lnc-TSI和TGF-β1促進乳腺癌細胞MCF-7和BT474轉移之間的關系，發現TGF-β1誘導乳腺癌細胞MCF-7和BT474發生EMT的同時上調Lnc-TSI水平，敲除和過表達Lnc-TSI分別促進和抑制TGF-β1介導的乳腺癌細胞MCF-7和BT474轉移。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 MCF-7和BT474購于ATCC。

1.1.2 試劑細胞因子 TGF-β1購于培譜生物公司。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗體購于CST公司。Lnc-TSI引物購于艾基公司。反轉錄試劑購于瑞真公司。RNA熒光定量試劑購于Takara公司。CRISPR-Cas 9敲除Lnc-TSI的慢病毒和過表達Lnc-TSI的慢病毒由南方醫科大學王鵬博士贈予。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養乳腺癌細胞 MCF-7和BT474均在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中培養，其中添加濃度100 U/mg的青霉素和濃度100 mg/mL的鏈霉素。細胞均在條件設定為37℃、5%CO2的培養箱里培養。TGF-β1處理無特殊說明均為10 ng/mL濃度的TGF-β1連續刺激72 h。

1.2.2 Western blot 使用添加1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的RIPA試劑冰上裂解細胞，裂解完全后在12 000 r/min速度下4℃離心30 min，用分光光度計測定濃度后在95℃下加熱5 min使蛋白完全變性。變性后的蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠系統中電泳，然后使用甲醇激活的0.45μm PVDF膜轉膜，按抗體說明書孵育相應一抗、二抗，在檢測化學發光的顯影儀器中顯影。

1.2.3 qRT-PCR 細胞的總RNA通過TRIZOL提取，在Roche 480平臺上按照說明書使用逆轉錄和熒光定量擴增試劑檢測Lnc-TSI表達水平。Lnc-TSI引 物 序 列 為Forward：5′AATCTGGTGTGGACAAACGC3′，Reverse：5′AACAGATGCTTCCGAATGCC3′。

1.2.4 CRISPR-Cas9 為了利用CRISPR-Cas9基因編輯構建敲除Lnc-TSI的細胞，兩個靶向Lnc-TSI的sgRNA被克隆到U6-multiple（sgRNA）-SV40-EGFP載體中。表達Cas9的載體為Lenti-Cas9-Puro載體。靶向Lnc-TSI的第一個CRISPR-Cas9系統兩個sgRNA序列如下：sgRNA1，5′TTCCAGCCAGG TATCAGAGT3′，sgRNA2，5′CACTGTGGGCATCTCAACCC3′。靶向Lnc-TSI的第二個CRISPR-Cas9系統兩個sgRNA序列如下：sgRNA1，5′GAGCTAATGCTGGTGCCGTG3′；sgRNA2，5′GGCTGTCGAGGCTGCAGCGA3′。根據說明書對靶細胞進行sgRNA慢病毒和Cas9慢病毒的共轉染。

1.2.5 過表達Lnc-TSI 用PCR技術擴增Lnc-TSI的全長cDNA并克隆到pCDH-EF1-MCS-Puro載體中，由此合成過表達質粒。空載的pCDH-EF1-MCSPuro載體和pCDH-EF1-MCS-Puro-lnc-TSI過表達載體在含有pMD2.BSBG和PSPAX2質粒的HEK293T細胞中包裝成慢病毒。按轉染慢病毒試劑的說明書給細胞轉染慢病毒，并且在轉染后72 h用嘌呤霉素對細胞進行篩選。

1.2.6 遷移實驗和侵襲實驗 遷移實驗時在transwell上室加入含有1×105個細胞的無血清培養基細胞懸液。TGF-β1處理組的上室細胞懸液中含有濃度為10 ng/mL的TGF-β1，PBS處理組的上室細胞懸液中含有與TGF-β1相同體積的PBS。Transwell下室添加含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基。上下室共同孵育8 h后將細胞用4%多聚甲醛室溫固定15 min，用0.1%結晶紫染色15 min。在顯微鏡下的五個隨機視野中對穿透膜的細胞進行計數。行侵襲實驗時把transwell上室用50 mL基質膠4℃包被過夜，其余步驟同遷移實驗。

1.3 數據分析

利用IBMSPSSstatistics 25對本實驗的數據進行統計分析，qRT-PCR和transwell實驗的組間對比選用t檢驗。結果的P值若小于0.05則被認為有統計學差異。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

2 結果

2.1 TGF-β1可誘導乳腺癌細胞MCF-7和BT474發生上皮-間充質轉化

首先建立TGF-β1誘導乳腺癌細胞MCF-7和BT474發生EMT的細胞模型。在10 ng/mL TGF-β1處理后72 h后，乳腺癌細胞MCF-7和BT474的形態對比PBS處理組從類圓形向梭形改變（圖1-A），western blot結果顯示細胞中的EMT相關蛋白Ecadherin下調，N-cadherin和Vimentin上調，并且隨著處理時間的增加蛋白水平變化程度加大（圖1-B）。Transwell實驗說明TGF-β1處理過后的乳腺癌細胞MCF-7和BT474侵襲能力增強（圖1-C，1-D）。這說明MCF-7和BT474在TGF-β1刺激下發生EMT改變。

圖1 TGF-β1促進乳腺癌細胞MCF-7和BT474的轉移 A：用TGF-β1（10 ng/mL）處理MCF-7和BT474細胞72 h后，對比PBS處理組，細胞形態明顯拉長呈紡錘形；B：用TGF-β1（10 ng/mL）處理MCF-7和BT474細胞0、24、48、72 h后，western blot檢測細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin水平；C：Transwell檢測用TGF-β1（10 ng/mL）處理MCF-7和BT474細胞72 h后對比PBS處理組細胞侵襲數目；D：統計transwell實驗的結果（**與PBS組相比P＜0.01）

2.2 TGF-β1上調乳腺癌細胞MCF-7和BT474中的Lnc-TSI表達

TGF-β1誘導乳腺癌細胞EMT細胞模型建立以后，要利用這一細胞模型探究Lnc-TSI在其中發揮的作用。首先我們研究了Lnc-TSI在乳腺癌細胞EMT過程中表達量是否發生變化。在沒有TGF-β1刺激的條件下，對比正常乳腺上皮細胞MCF-10A，乳腺癌細胞MCF-7和BT474中的Lnc-TSI水平更高（圖2-A），而TGF-β1處理能顯著上調乳腺癌細胞MCF-7和BT474中的Lnc-TSI表達（圖2-A）。在證實乳腺癌細胞EMT過程中Lnc-TSI表達上調后，通過敲除和過表達來探究Lnc-TSI在這個細胞模型中的功能。在乳腺癌細胞MCF-7和BT474中敲除Lnc-TSI，發現Lnc-TSI表達顯著下調（圖2-B）。在乳腺癌細胞MCF-7和BT474中過表達Lnc-TSI后，Lnc-TSI表達顯著上調（圖2-C）。

圖2 Lnc-TSI在TGF-β1介導的乳腺癌細胞EMT中上調 A：qRT-PCR檢測正常乳腺上皮細胞MCF-10A和TGF-β1處理后乳腺癌細胞MCF-7、BT474的Lnc-TSI表達水平（***與PBS組相比P＜0.001）；B：qRT-PCR檢測敲除Lnc-TSI后乳腺癌細胞MCF-7、BT474中的Lnc-TSI表達水平（**與PBS組相比P＜0.01）；C：qRT-PCR檢測過表達Lnc-TSI后乳腺癌細胞MCF-7、BT474中的Lnc-TSI表達水平（***與PBS組相比P＜0.001）

2.3 Lnc-TSI抑制TGF-β1介導的乳腺癌細胞MCF-7和BT474轉移

上述實驗已經證明乳腺癌細胞MCF-7和BT474中敲除和過表達Lnc-TSI的效率，在此基礎上通過transwell實驗探究Lnc-TSI表達的改變在TGF-β1介導的乳腺癌細胞EMT模型中是否會引起表型的變化。敲除乳腺癌細胞MCF-7和BT474的Lnc-TSI后，在沒有TGF-β1刺激的條件下，MCF-7和BT474細胞的侵襲遷移數目明顯增加，這個現象在TGF-β1處理后的EMT模型中更加明顯（圖3-A）。相反，過表達Lnc-TSI能顯著降低MCF-7和BT474細胞的侵襲遷移數目，在TGF-β1處理的EMT模型中更加明顯（圖3-B）。由此證實了在TGF-β1介導的乳腺癌細胞EMT模型中改變Lnc-TSI的表達能引起侵襲遷移表型的改變，Lnc-TSI能抑制TGF-β1介導的乳腺癌轉移。

3 討論

乳腺癌是常見于女性的惡性腫瘤，其轉移的機制尚未被完全闡述清楚。已有研究報道TGF-β信號通路在乳腺癌的EMT進展中起重要作用［10］。TGF-β1是激活TGF-β信號通路的關鍵分子之一，因此，本研究選擇使用TGF-β1作為構建乳腺癌EMT細胞模型的刺激分子［18］。Lnc-TSI在腎癌中已經被報道能通過TGF-β信號通路調控腎癌細胞EMT進展，最終影響腎癌細胞的轉移。但乳腺癌的轉移與Lnc-TSI的相關性尚未被報道［19］?；谏鲜龌A，本研究在使用TGF-β1構建的乳腺癌細胞EMT模型中探究了Lnc-TSI與乳腺癌轉移之間的關系。

為了說明TGF-β1能成功構建乳腺癌細胞EMT模型，本研究使用10 ng/mL的TGF-β1處理乳腺癌細胞MCF-7和BT474 72 h。從細胞形態的梭形改變，western blot檢測EMT相關蛋白E-cadherin下調和N-cadherin、Vimentin上調，細胞侵襲數目增加三個方面證實MCF-7和BT474細胞發生EMT改變。在乳腺癌EMT細胞模型構建成功的前提下，實驗證實Lnc-TSI的表達在TGF-β1介導的EMT過程中上調，說明TGF-β信號通路的激活會導致乳腺癌細胞MCF-7和BT474中Lnc-TSI水平升高，Lnc-TSI和TGF-β信號通路之間存在相關性。為了進一步探究Lnc-TSI是否能通過調控TGF-β信號通路對細胞的侵襲遷移表型產生影響，在MCF-7和BT474細胞中分別敲除和過表達Lnc-TSI，transwell實驗證實敲除和過表達Lnc-TSI會分別增加和減少乳腺癌細胞MCF-7和BT474的侵襲遷移數目，在TGF-β1處理72 h后的MCF-7和BT474細胞中這個現象會更加明顯，這反映了Lnc-TSI能抑制腺癌細胞MCF-7和BT474的EMT進程，而這種作用很大程度上又依賴于TGF-β1刺激活化的TGF-β信號通路。Lnc-TSI通過TGF-β信號通路實現了對乳腺癌MCF-7和BT474的EMT和侵襲遷移的調控。然而，本研究尚未揭示Lnc-TSI與TGF-β信號通路之間的分子聯系，Lnc-TSI在乳腺癌中影響TGF-β信號通路的分子機制是否與在腎癌中報道的抑制，這些問題都將是我們下一步研究的關鍵。

研究普遍認為TGF-β1介導的EMT與smad蛋白家族有關，TGF-β1結合TGF-β受體激活胞內段激酶磷酸化smad2和smad3蛋白，磷酸化的smad2和smad3與smad4結合形成轉錄因子復合體，入核通過調控下游靶基因的表達介導細胞的EMT進程［20］。然而，TGF-β1還能通過多種其他途徑調控EMT，比如MAPK通路和PI3K/AKT通路等［21］。本研究證明了長鏈非編碼RNA Lnc-TSI與參與了TGF-β1對EMT的調控，說明非編碼RNA在TGF-β1信號通路中也能發揮重要的作用。然而，包括Lnc-TSI在內的非編碼RNA是否能跟通路其他下游蛋白產生聯系？這個問題尚有待我們探究。

綜上所述，Lnc-TSI在TGF-β1促進乳腺癌細胞MCF-7和BT474的侵襲遷移的過程中表達上調，Lnc-TSI能抑制TGF-β1介導的乳腺癌細胞MCF-7和BT474的侵襲遷移的增加。