肝癌患者中RNF24的表達及臨床價值

伍雋華，陳云揚，張鑫，余杰雄，崔恩銘，張慧玲

肝細胞癌（HCC）是最常見的原發性肝臟惡性腫瘤，全世界范圍內常見的致死腫瘤之一［1］。隨著現代科學技術的發展，越來越多的檢查方法與篩查手段被挖掘。然而，肝癌的早期檢出率及患者的預后仍不盡如人意，有關研究、探索依然有很大的空間［2，3］。為進一步做好肝癌的早期篩查及精準防治工作，新型腫瘤標記物的發現至關重要。RNF24是一種定位于高爾基體膜中新型膜蛋白，該蛋白含有鋅指結構，可與瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）的錨蛋白樣重復結構域相互作用并影響TRPC細胞內運輸［4］。我們前期生信篩查提示，較癌旁組織而言，RNF24在肝癌組織中呈高表達趨勢。當前，RNF24在腫瘤（包括肝癌）中作用罕有研究報道，RNF24在肝癌發生、發展中扮演什么角色仍不清楚。本研究擬借助大數據時代提供的機遇，利用公共數據資源、探討RNF24在肝癌中表達及其對肝癌患者預后的影響。同時，通過分析RNF24與腫瘤微環境中免疫細胞浸潤的關系，探究RNF24在肝癌中發揮作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 數據收集

從Firebrowse網站下載具有完整臨床信息（包含生存信息）的肝癌患者RNA-seq數據205例，其中男性患者135例，女性患者70例。根據操作說明解碼數據，進行后續分析。

1.2 臨床指標選擇

結合數據庫提供臨床參數的實際情況，經過專家篩選，本研究納入了患者性別、年齡、體重、白蛋白水平、甲胎蛋白（AFP）水平、血小板、凝血酶原時間、膽紅素、腫瘤分級、血管侵犯、腫瘤重量及腫瘤壞死百分比等臨床指標，進行患者預后分析。

1.3 RNF24 mRNA在肝癌中的表達

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）是一個在線工具，主要包含各種不同類型的腫瘤患者RNAseq數據［5］。本文利用此平臺分析RNF24基因表達水平及其與肝癌患者臨床特征之間的關系。

1.4 RNF24蛋白在肝癌中的表達

HPA數據庫（https：//www.proteinatlas.org）包含近20種不同腫瘤的基因表達信息［6］。本研究使用該工具評估正常組織和癌組織中RNF24蛋白質表達水平。分析過程由兩人獨立進行，并通過Image J軟件進行定量分析。

1.5 RNF24與免疫細胞浸潤的相關性

TIMER數 據 庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是腫瘤免疫研究經典數據庫，用于分析各種癌癥中基因表達與免疫細胞浸潤之間的相關性［7］。本研究分析了肝癌患者RNF24表達與B淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞，巨噬細胞，中性粒細胞和樹突狀細胞浸潤之間的關系。同時，我們采用多變量Cox分析探討常見臨床指標、浸潤免疫細胞亞群及RNF24表達對患者預后的影響。

1.6 RNF24對肝癌患者預后的影響

Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot.com/analysis/）平臺是一個經典的生存分析工具［8］。本項研究分析了RNF24在364例肝癌癥患者的總生存期（OS）、無進展生存期（PFS）、無復發生存期（RFS）及疾病特異性生存期（DSS），預測RNF24在肝癌患者預后中的價值。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以表示，兩組數據比較采用t檢驗。采用多變量Cox分析探討RNF24、免疫浸潤及常見臨床指標對預后的影響；采用單變量/多變量Cox比例風險回歸模型確定RNF24表達與患者生存率的關系；采用Kaplan-Meier法評估RNF24對肝癌患者生存的影響。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNF24在肝癌中表達及與腫瘤分期、分級的關系

UALCAN數據庫檢測RNF24 mRNA在肝癌中表達量中位值（median，M）為0.712（q1=0.376，q3=1.287），明顯高于正常肝組織中位值0.265（q1=0.17，q3=0.371）（P＜0.01；圖1A）。進一步，我們分析RNF24表達水平與肝癌分級、臨床分期之間的關系，結果表明隨著腫瘤中RNF24表達水平的升高，患者臨床分期、腫瘤分級越差（圖1B、1C）。最后，我們利用HPA數據資源發現RNF24在肝癌組織中蛋白表達水平比對應正常肝組織高（圖1D、1E、1F）。

2.2 RNF24在肝癌中表達與免疫細胞浸潤的關系

利用TIMER數據庫探究RNF24與免疫細胞浸潤之間的相關性，我們發現B淋巴細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞的浸潤水平與RNF24水平呈正相關（圖2A，所有P＜0.05）。進一步，使用多變量Cox分析來探究免疫細胞浸潤、常見臨床指標及RNF24表達水平對肝癌患者預后的影響。結果顯示，腫瘤分期、CD8+T細胞和樹突狀細胞浸潤以及RNF24表達都是影響肝癌預后的影響因素。并且，盡管RNF24表達對肝癌患者1年生存期無顯著影響，但RNF24是患者3年、5年生存期的危險因素（表1；圖2B、2C、2D）。

圖1 RNF24在肝癌中表達譜及與腫瘤臨床分期、分級的關系 圖A：RNF24在TCGA的表達情況（UALCAN）；圖B：RNF24表達與肝癌腫瘤分期的關系（UALCAN）；圖C：RNF24表達與肝癌腫瘤分級的關系（UALCAN）；圖D～F：RNF24在肝癌中的蛋白表達情況（HPA）

表1 336例肝癌患者免疫浸潤、RNF24表達及常見臨床指標對患者預后的Cox分析

2.3 RNF24對患者臨床預后的影響

通過Kaplan-Meier生存分析，我們發現RNF24表達水平越高的肝癌患者總體生存率越短（HR=2，95%CI：1.42～2.84；P=6.3e-5；圖3A）。進一步分析PFS，RFS和DSS時，我們發現類似的結果（圖3B、3C、3D），這些結果均表明RNF24高表達與肝癌患者的不良預后顯著相關。

圖2 肝癌中RNF24表達與免疫浸潤的相關性 圖A：RNF24表達與免疫細胞浸潤之間的相關性；圖B～D：免疫浸潤、RNF24表達對肝癌患者1年、3年和5年生存期的影響

圖3 RNF24對患者生存的影響 圖A：總體生存期（OS）；圖B：無進展生存期（PFS）；圖C：無復發生存期（RFS）；圖D：疾病特異性生存期（DSS）

2.4 RNF24是肝癌患者預后的獨立危險因素

從Firebrowse網站下載RNF24表達和對應患者臨床信息數據，經過兩位專家獨立篩查，我們納入了具有完整信息的205例肝癌患者、12個常見臨床指標進行單因素與多因素Cox回歸分析。患者臨床信息見表2。單因素與多因素Cox回歸分析結果見表3，結果顯示在單因素分析中，總膽紅素（TB）水平（HR=21.354，95%CI：5.942～76.743，P＜0.001），腫瘤重量（HR=1.001，95%CI：1.000～1.001，P＜0.001）和RNF24表達水平（HR=1.003，95%CI：1.000～1.005，P=0.011）為患者總體存活率（OS）的危險因素；多因素分析結果提示，總膽紅素水平、腫瘤重量及RNF24表達水平與患者總體生存率顯著相關。

表3 205例肝癌患者Cox生存分析

3 討論

RNF（RINGFinger）蛋白是一類包含環指基序的鋅指蛋白，可以結合E3泛素化酶及其底物，起連接酶的作用，促進目標蛋白的降解［9］。研究表明，RNF在調節細胞分化，生長和轉化中起著重要作用，RNF的異常表達亦可導致某些腫瘤的發生、發展［10］。RNF24作為家族中重要的一員，其在生命活動調節中所起的作用也備受關注。Lussier等［4］在研究中指出，RNF24與高爾基體中的TRPC相互作用并影響TRPC胞內運輸，但不會影響其活性。然而，RNF24在肝癌中的作用沒有報道，其內在機制仍有待探究。

本研究利用信息時代提供的契機，通過挖掘數據庫中RNF24基因在肝癌中的表達及作用的有關信息，充分利用數據資源。我們的研究結果表明，無論從mRNA水平還是蛋白質水平，RNF24基因在肝癌組織中的表達顯著高于在正常肝組織中的表達。同時，臨床資料分析結果提示高表達的RNF24與肝癌患者臨床分期、腫瘤分級顯著相關，這也提示了RNF24在肝癌患者中可能作為一種預后不良預測因子。進一步，我們檢測了RNF24水平與免疫浸潤細胞的相關性，腫瘤微環境中免疫細胞浸潤已被證明是多種癌癥的預后影響因素［11，12］。本研究顯示RNF24水平與某些免疫細胞浸潤相關，但腫瘤微環境中的免疫細胞如何影響RNF24的表達，促進肝癌的生長、進展，尚需進一步研究。最后，本研究利用Kaplan-Meier生存數據庫分析，結果提示RNF24高表達的肝癌患者生存期更短。單因素及多因素Cox回歸分析表明RNF24高表達是肝癌患者預后的獨立危險因素。

綜上，RNF24基因可能通過影響腫瘤微環境中的免疫細胞的組成及比例影響肝癌患者的預后。RNF24在肝癌的發生、發展中扮演重要角色，有望成為肝癌患者預后預測的一種新型標記物。深入研究其發揮作用的內在機理，未來可為肝癌的精準防治提供新的思路。