PD-1/PD-L1在子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)及其臨床意義

張夢(mèng)雪 孫慧敏 高建芳 張維新 柳 林

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，其發(fā)生率在世界范圍內(nèi)逐年上升，呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)[1]。其病理類型以子宮內(nèi)膜樣腺癌為主，約占80%～90%。早期EC可行手術(shù)治療，預(yù)后良好，5年生存率為74%～91%，而Ⅰb～Ⅳ期、復(fù)發(fā)及Ⅰa期伴高危因素的患者手術(shù)療效不佳，5年生存率僅20%～26%，尚需輔助放化療或聯(lián)合治療等[2]。近年來(lái)，PD-1/PD-L1等免疫檢查點(diǎn)成為新的研究熱點(diǎn)，免疫治療或成為新的癌癥治療方案之一[3]。

程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death protein 1, PD-1)，主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，是由PDCD1基因編碼的Ⅰ型膜蛋白，其配體為PD-L1和PD-L2。程序性細(xì)胞死亡配體-1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)是一種由CD274基因編碼的跨膜蛋白，可廣泛表達(dá)于T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及心、肺等器官[4～6]。當(dāng)PD-L1與活化T淋巴細(xì)胞表面PD-1結(jié)合時(shí)，可阻斷抗原遞呈信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻礙機(jī)體的免疫監(jiān)視作用，有利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[7]。Konishi等[8]于2004年證明了PD-L1在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)，提出PD-1/PD-L1信號(hào)通路可能為非小細(xì)胞肺癌抗腫瘤免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控機(jī)制之一。隨后研究者陸續(xù)在頭頸癌、結(jié)膜黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤組織發(fā)現(xiàn)了PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)，提示其與實(shí)體腫瘤的相關(guān)性[9～12]。本研究通過(guò)檢測(cè)PD-1、PD-L1在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)情況，初步分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，從而探討其與子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)系，以期為子宮內(nèi)膜癌的免疫治療提供更多的理論依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象:石蠟切塊組織選自2015年1月～2020年5月山東省濰坊市人民醫(yī)院病理科的150例患者，分為正常子宮內(nèi)膜組(對(duì)照組)，患者平均年齡56.0歲；子宮內(nèi)膜不典型增生組(實(shí)驗(yàn)組A)，患者平均年齡52.3歲；高分化子宮內(nèi)膜樣腺癌組(實(shí)驗(yàn)組B)，患者平均年齡57歲；中分化子宮內(nèi)膜樣腺癌組(實(shí)驗(yàn)組C)，患者平均年齡57.8歲；低分化子宮內(nèi)膜樣腺癌組(實(shí)驗(yàn)組D)，患者平均年齡58.2歲，每組30例。所有納入對(duì)象術(shù)前均未接受過(guò)放化療或雌孕激素治療，未合并其他惡性腫瘤，臨床病理資料完整。

2.主要設(shè)備及試劑：采用常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司提供的組織包埋冷凍臺(tái)、組織漂烘儀及石蠟切片機(jī)等，小鼠抗人PD-1/PD-L1單克隆抗體、小鼠/兔聚合物通用型試劑盒、EDTA抗原修復(fù)液等購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.方法：所有組織標(biāo)本均按3μm連續(xù)切片。免疫組化采用EnVision二步法，步驟嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。常規(guī)烤片、脫蠟后進(jìn)行高壓修復(fù)，選用pH值9.0 EDTA抗原修復(fù)液修復(fù)，3%H2O2進(jìn)行阻斷，隨后依次滴加一抗(小鼠抗人PD-1/PD-L1單克隆抗體)、二抗(酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，隨后顯色、復(fù)染、透明后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下閱片。以PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，采用已知PD-1及PD-L1表達(dá)陽(yáng)性的扁桃體組織為陽(yáng)性對(duì)照。

4.結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生獨(dú)立雙盲完成結(jié)果讀取。先低倍鏡下觀察，隨后在腫瘤或腫瘤間質(zhì)區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)×100%。染色強(qiáng)度分級(jí)：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞密度分級(jí)：<1%為0分，1%～5%為1分，5%～50%為2分，>50%為3分。兩項(xiàng)得分相乘，結(jié)果0～1分為陰性表達(dá)，2～9分為陽(yáng)性表達(dá)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.不同子宮內(nèi)膜組織中 PD-1及PD-L1的表達(dá)水平:EnVision法顯示PD-1、PD-L1抗原陽(yáng)性物為棕黃色顆粒，均定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。PD-1可表達(dá)于子宮內(nèi)膜樣腺癌周圍浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞上，細(xì)胞表現(xiàn)為小圓形，核大質(zhì)少，點(diǎn)樣分布；PD-L1可表達(dá)于子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞及癌間質(zhì)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞上(圖1)。PD-1在子宮內(nèi)膜樣腺癌間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率為28.89%(26/90)，高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織(3.33%)和正常子宮內(nèi)膜組織(0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但在子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞中均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。PD-L1在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為46.67%(42/90)，高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織(3.33%)和正常子宮內(nèi)膜組織(0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PD-1在子宮內(nèi)膜樣腺癌間質(zhì)淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率按分化程度由低到高依次為43.33%、30.00%、13.33%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.819,P<0.01)；PD-L1在子宮內(nèi)膜樣腺癌的陽(yáng)性表達(dá)率按分化程度由低到高依次為63.33%、46.67%、30.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=43.589,P<0.01，表1)。

表1 PD-1、PD-L1在不同子宮內(nèi)膜及間質(zhì)組織中的表達(dá)率[n(%)]

圖1 PD-1在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)(EnVision法，×400)

2.PD-1和PD-L1與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的關(guān)系:分析90例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者中PD-1和PD-L1的表達(dá)(表2)。PD-1和PD-L1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的FIGO分期、年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與子宮內(nèi)膜樣腺癌組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織學(xué)分級(jí)為低分化(G3)、中分化(G2)、高分化(G1)者PD-1和PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率逐步上升，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，腫瘤浸潤(rùn)程度達(dá)深肌層及以上者的PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于未侵及深肌層者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中PD-1、PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

討 論

對(duì)PD-1/PD-L1通路的研究表明，正常機(jī)體中T淋巴細(xì)胞在靜息狀態(tài)下低表達(dá)PD-1，抗原進(jìn)入機(jī)體后，抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells, APC)遞呈的抗原肽與T淋巴細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)結(jié)合，同時(shí)B7分子與CD28協(xié)同作用傳遞信號(hào)，從而激活T淋巴細(xì)胞，分化增殖為效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮免疫殺傷作用。而T淋巴細(xì)胞的激活可引起PD-1的表達(dá)上調(diào)，在TCR的刺激下，PD-1與PD-L1結(jié)合促使PD-1胞內(nèi)區(qū)ITIM和ITSM酪氨酸磷酸化，并與SHP-1或SHP-2結(jié)合并使之磷酸化，進(jìn)一步引起PTEN表達(dá)上調(diào)，從而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性，Akt活性的阻滯最終抑制下游T淋巴細(xì)胞的增殖與活化[13～15]。這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用能夠維持T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)抗原的清除以及維持機(jī)體平衡至關(guān)重要[16]。當(dāng)人體被腫瘤侵襲時(shí)，將打破機(jī)體免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與T淋巴細(xì)胞表面的PD-1特異性結(jié)合，通過(guò)激活PD-1/PD-L1下游通路，過(guò)度抑制T淋巴細(xì)胞的增殖分化，并招募免疫抑制細(xì)胞及細(xì)胞因子，降低腫瘤細(xì)胞抗原性以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷作用，形成腫瘤免疫逃逸[17,18]。因此，阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路能重啟免疫監(jiān)視，恢復(fù)T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用，是腫瘤免疫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

在子宮內(nèi)膜癌方面，國(guó)外已有少數(shù)病例研究報(bào)告了PD-1抑制劑在子宮內(nèi)膜癌治療中的療效。如Fader等[19]報(bào)道了應(yīng)用PD-1抑制劑Pembrolizumab治療錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷型復(fù)發(fā)性EC，總反應(yīng)率和疾病控制率可達(dá)55%和89%。證實(shí)了PD-1/PD-L1免疫治療確實(shí)能讓部分EC患者獲益，但缺乏實(shí)驗(yàn)研究闡述PD-1/PD-L1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌中發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，對(duì)于能否將PD-1/PD-L1作為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后評(píng)估因素，如何有效篩選獲益患者，有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，PD-1/PD-L1在子宮內(nèi)膜樣腺癌的表達(dá)水平顯著高于在子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜，且隨著子宮內(nèi)膜樣腺癌分化程度的降低表達(dá)水平上升。因此PD-1/PD-L1通路的確參與了子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，但其分子機(jī)制尚需基礎(chǔ)研究來(lái)闡明。此外有兩個(gè)意外現(xiàn)象，當(dāng)子宮內(nèi)膜樣腺癌腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)一定水平鱗化后，PD-L1的表達(dá)水平上升，而在少數(shù)合并透明細(xì)胞癌等惡性程度較高的組織中，PD-L1表達(dá)水平也有顯著上升。故推測(cè)PD-L1表達(dá)水平或與腫瘤細(xì)胞的病理類型密切相關(guān)，這一假設(shè)尚需數(shù)據(jù)支持。

此外，本研究進(jìn)一步分析了PD-1/PD-L1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜樣腺癌的臨床病理特征之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌的組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，且隨著腫瘤惡性程度的增加，PD-1/PD-L1表達(dá)水平上升，這也提示了PD-1/PD-L1可能參與了子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展。盡管實(shí)驗(yàn)未能證明PD-1/PD-L1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌的FIGO分期相關(guān)，但已發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜樣腺癌的肌層浸潤(rùn)程度相關(guān)，且隨著浸潤(rùn)程度加深，PD-L1表達(dá)水平上升。考慮到實(shí)驗(yàn)納入的病例數(shù)尚不充足，若擴(kuò)大樣本量或能夠驗(yàn)證其與腫瘤FIGO分期的關(guān)系。

綜上所述，本研究證實(shí)了PD-1/PD-L1在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中存在顯著表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)水平隨著子宮內(nèi)膜樣腺癌的惡性程度加重而上升，提示PD-1/PD-L1表達(dá)或參與了子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。但研究尚存不足之處，即PD-1/PD-L1表達(dá)水平低于相關(guān)研究中同種病理類型的肺腺癌、卵巢癌的表達(dá)水平，且選取的病例隨訪時(shí)間較短，未能進(jìn)一步研究生存分析，因此建議開(kāi)展多中心、大樣本量的研究，全面分析PD-1/PD-L1通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展中的作用，以篩選獲益人群，提高PD-1/PD-L1免疫治療在臨床中的療效和安全性。