慢性乙型肝炎患者濾泡輔助性T細(xì)胞相關(guān)表達(dá)分子與自身抗體的表達(dá)分析

梁淑慧 黃燕曉 李 翠 孫六娜 鄧日輝 黃 惠 周迎春

CD4+T細(xì)胞是機體免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫應(yīng)答功能的主要效應(yīng)細(xì)胞之一, 濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells，Tfh)是CD4+T細(xì)胞近年發(fā)現(xiàn)的又一新亞群，主要對B細(xì)胞誘發(fā)體液免疫和長壽命漿細(xì)胞的形成提供幫助。Tfh細(xì)胞定位于淋巴濾泡生發(fā)中心，可持續(xù)的表達(dá)趨化因子受體5(CXCR5)和高水平的誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子(ICOS)及程序性死亡分子-1(PD-1)，產(chǎn)生效應(yīng)因子IL-21、B-淋巴細(xì)胞趨化因子(CXCL13)是其分化發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[1]。人轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)能協(xié)助IL-21促進(jìn)初始B細(xì)胞增殖和分化。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，Tfh細(xì)胞及其相關(guān)表達(dá)分子在RA和SLE等自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中有重要關(guān)系[2～4]。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)除有肝臟免疫病理損傷外，還存在由自身免疫反應(yīng)引起的免疫損傷，其共同導(dǎo)致包括肝和肝外組織在內(nèi)的機體免疫損傷，且與乙肝的臨床類型、進(jìn)程、病程相關(guān)，但具體的自身免疫應(yīng)答機制未明[5]。本研究主要探討CHB患者外周血中Tfh細(xì)胞相關(guān)表達(dá)分子CXCR5、CXCL13、IL-21和TGF-β2的表達(dá)水平，并觀察CHB患者自身抗體出現(xiàn)的頻率，分析其關(guān)聯(lián)性。

對象與方法

1.研究對象：(1)選取2018年10月～2019年3月于筆者醫(yī)院就診的門診或病房CHB患者共50例，其中男性29例，女性21例，患者年齡20～65歲，平均年齡為37.74±11.63歲，診斷符合《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)》，同時排除合并甲、丙、丁、戊型等病毒性感染，以及藥物性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病等其他肝炎。(2)選取來筆者醫(yī)院體檢中心做體檢的健康人群共30例，其中男性17例，女性13例，年齡20～60歲，平均年齡為35.80±12.42歲，既往體健，無肝臟、腎臟、胃、腸道疾病史，經(jīng)實驗室檢測排除HBV感染和ALT、AST異常。

2.方法：(1)所有入組對象均知情同意后留取空腹血4ml，離心分離血清，置于-70℃冷凍保存待用。(2)采用ELISA定量檢測試劑盒(上海一基實業(yè)有限公司)分別測定CHB患者組和對照組CXCR5、CXCL13、IL-21和TGF-β2，嚴(yán)格按操作說明進(jìn)行，在ELX808酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)上比色，計算定量結(jié)果。(3)采用間接免疫熒光法檢測試劑盒[歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國)有限公司]分別測定CHB患者組和對照組ANA、抗肝腎微粒體抗體(liver kidney microsomal antibody，LKM)、抗肝細(xì)胞溶質(zhì)抗原Ⅰ型(liver cytosolic 1，LC1)抗體、抗平滑肌抗體(anti-smooth muscle antibody，ASMA)和抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody，AMA)，Olympus熒光顯微鏡下判斷結(jié)果，ANA同時區(qū)分核型。標(biāo)本起始檢測效價為1∶100，如細(xì)胞不顯示特異性熒光，則判為陰性。如細(xì)胞顯示特異性熒光模型，則繼續(xù)做1∶320、1∶1000的稀釋，至細(xì)胞不顯示特異性熒光。

結(jié) 果

1.CHB組與對照組外周血Tfh細(xì)胞相關(guān)表達(dá)分子分析：CHB組CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21均明顯高于對照組，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 CHB組與對照組外周血CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21的比較

2.CHB組與對照組外周血自身抗體測定：CHB組自身抗體陽性率(26%)明顯高于健康對照組(3.33%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，熒光強度以低效價(1∶100)為主(占76.9%)。ANA陽性熒光核型表現(xiàn)為核顆粒型7例，胞質(zhì)顆粒型1例，胞質(zhì)纖維型1例和1例混合核型(核仁型和核顆粒型)，對照組檢測有1例ANA陽性，其熒光核型表現(xiàn)為核顆粒型(1∶100)。CHB組ASMA抗體陽性率為6%，未檢出AMA抗體、LC1抗體和LKM抗體，對照組未檢出此4種抗體,詳見表2。

表2 CHB組與對照組自身抗體結(jié)果比較[n(%)]

3.CHB患者自身抗體陽性者與陰性者Tfh細(xì)胞相關(guān)表達(dá)分子表達(dá)差異：對13例自身抗體陽性的CHB患者與其余37例自身抗體陰性的CHB患者的CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表3 CHB患者自身抗體陽性者與陰性者Tfh細(xì)胞相關(guān)表達(dá)分子的表達(dá)差異

討 論

目前認(rèn)為，效應(yīng)Tfh細(xì)胞與高親和力B細(xì)胞的相互作用促進(jìn)了生發(fā)中心的形成和維持，促使B細(xì)胞增殖、抗體類別轉(zhuǎn)換，以及分化成為漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞，導(dǎo)致某類高效價自身抗體的產(chǎn)生，機體體液免疫應(yīng)答發(fā)生紊亂[6，7]。因此，Tfh細(xì)胞功能正常與否是決定機體抗體免疫應(yīng)答發(fā)生的主要因素[8]。在本研究中，CHB患者外周血中CXCR5和其配體CXCL13表達(dá)水平明顯高于健康對照組，提示HBV感染人體后可引起Tfh細(xì)胞增殖，從而使外周血中CXCR5、CXCL13表達(dá)增加，并參與HBV所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Liu等[9]研究還發(fā)現(xiàn)，CXCL13的水平與替比西林治療期間HBV的免疫控制有關(guān)。CHB患者組外周血中IL-21表達(dá)水平明顯高于健康對照組，表明HBV感染人體后引起Tfh細(xì)胞分泌IL-21增多，其能進(jìn)一步誘導(dǎo)漿細(xì)胞的分化，分泌更多相應(yīng)的免疫球蛋白，同時通過Tfh細(xì)胞自身表達(dá)的IL-21R，也可誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞分化，并促進(jìn)其表面 CXCR5、ICOS 的表達(dá)[10]。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長、分化及凋亡等，也可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成[11]。TGF-β可分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，有研究表明，TGF-β2有誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，輔助B細(xì)胞增殖、成熟，發(fā)生抗體類別轉(zhuǎn)換等作用[12～14]。本研究中CHB組外周血TGF-β2表達(dá)水平也明顯增高，顯示HBV感染人體后能刺激機體細(xì)胞產(chǎn)生更多的TGF-β2，增多的TGF-β2和IL-21協(xié)同作用促進(jìn)初始B細(xì)胞增殖和分化，發(fā)揮機體免疫應(yīng)答以及清除病毒的作用[14]。

HBV感染常伴隨自身免疫表現(xiàn)和(或)自身免疫性疾病，患者體內(nèi)出現(xiàn)自身抗體，從而可能引起肝外和肝內(nèi)組織的免疫損傷，加重患者的臨床表現(xiàn)。但目前報道的自身抗體出現(xiàn)的頻率不一，檢測到的自身抗體種類也不盡相同[15～18]。本研究中CHB患者ANA的陽性率與Li等[17]研究結(jié)果基本一致，ASMA陽性率則略高于譚朝霞等[18]的研究結(jié)果，其余AMA、LC1抗體和LKM抗體陽性率與其研究基本一致。CHB組和對照組之間的自身抗體陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可見這些自身抗體的頻率增加與HBV的慢性感染有關(guān)，患者體內(nèi)免疫功能已出現(xiàn)紊亂。自身抗體總陽性率較Acay等[15]和Sener等[16]的研究結(jié)果略高，較Li等[17]的研究結(jié)果低，可能與入組CHD患者所處的感染不同狀態(tài)以及檢測的自身抗體類型與數(shù)量不同有關(guān)。Li等[17]研究的CHB患者中抗Ro52抗體就有28%的陽性率，也有報道在干擾素等藥物治療后CHB患者體內(nèi)自身抗體的檢出率更高，而且自身抗體的檢出率也有隨病情發(fā)展而增高的趨勢，與肝功能損害的程度及HBV病毒復(fù)制水平相關(guān)[19～23]。

ANA免疫熒光核型可分為多種，常見包括核均質(zhì)型、核顆粒型、核仁型、核點型、核膜型、著絲點型、胞質(zhì)顆粒型、胞質(zhì)纖維型等，不同的核型對應(yīng)的靶抗原不同。本研究CHB患者的核型表現(xiàn)以核顆粒型為主(70%)，另有混合核型(核仁型和核顆粒型)占10%，且熒光效價為1∶320，Sener等[16]的研究中熒光核型也以核仁型(37.5%)和核顆粒型(25%)為主。核仁型有隨病情的衍變而增高的趨勢，提示在慢性肝病衍變過程中自身免疫的變化可能多集中在與細(xì)胞增殖、分裂有關(guān)的核仁成分上[18]。

本研究表明，CHB患者體內(nèi)存在自身免疫紊亂現(xiàn)象，其Tfh細(xì)胞相關(guān)表達(dá)分子CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21也明顯高于對照組，因此對自身抗體陽性的CHB患者和自身抗體陰性的CHB患者的CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21分別進(jìn)行比較分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明本研究中CHB患者體內(nèi)自身抗體的出現(xiàn)與Tfh細(xì)胞相關(guān)表達(dá)分子CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21的關(guān)聯(lián)性并不強。但本研究只觀察了CHB患者中ANA、ASMA、AMA、LC1抗體和LKM抗體等6種與肝臟疾病有較大關(guān)聯(lián)的自身抗體，而且CHB患者中自身抗體陽性組只有13例，例數(shù)偏少，尚不能代表總體數(shù)據(jù)，有待于進(jìn)一步擴大樣本量，同時觀察其他更多種類的自身抗體進(jìn)行深入地研究。