花旗澤仁主要活性成分在大鼠胰島素抵抗脂肪組織的分布

李佳欣 朱 蕾 陳思琦 葛鵬玲

胰島素抵抗(IR)是一種病理生理狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，細(xì)胞對胰島素降血糖活性的反應(yīng)性降低。IR常與高胰島素血癥、腰圍增加或內(nèi)臟肥胖、高甘油三酯和低高密度脂蛋白的代謝性血脂異常以及脂肪變性有關(guān)，這些特征統(tǒng)稱為代謝綜合征，稱之為“普通胰島素抵抗”[1]。

在過去的20年里，一致性觀點(diǎn)認(rèn)為脂肪組織是肝臟和骨骼肌代謝和細(xì)胞信號的主要調(diào)節(jié)者[2,3]。因此，高脂飲食(HFD)或肥胖條件下的脂肪組織功能障礙被認(rèn)為通過循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外顯體的潛在釋放，向其他代謝組織傳遞破壞性信號[3～6]。可能存在3種機(jī)制來調(diào)節(jié)這種脂肪組織對其他組織的控制和全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)：①通過促進(jìn)合成或限制脂解，在白色脂肪細(xì)胞庫中進(jìn)行脂質(zhì)隔離，從而防止有毒脂質(zhì)在肝臟和骨骼肌中積聚并受到損害在脂肪營養(yǎng)不良[7,8]；②特殊的米色和棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和脂肪酸氧化率高，增加了能量消耗并減少了脂質(zhì)負(fù)荷[9,10]；③生物活性因子的分泌，這些生物活性因子可以靶向大腦、肝臟、骨骼肌、胰島或其他組織[11,12]。

從IR肺胃熱盛、津氣兩傷、腎氣虧虛等病理特點(diǎn)出發(fā)，故用西洋參補(bǔ)陰清熱之功，補(bǔ)肺胃之陰，清肺胃之熱；澤瀉清熱利濕，化濁降脂之利；薏苡仁滲濕止瀉，除痹散結(jié)之功，組成花旗澤仁中藥復(fù)方。但花旗澤仁治療2型糖尿病胰島素抵抗的主要活性成分被機(jī)體吸收后，能否被在靶組織或靶器官達(dá)到一定的分布濃度，是其發(fā)揮改善胰島素抵抗的關(guān)鍵所在。實(shí)驗(yàn)對大鼠灌胃花旗澤仁水煎液后，測定人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯和9-HODE相于胰島素抵抗相關(guān)組織——脂肪組織中的濃度，觀察這些成分在脂肪組織中的分布特點(diǎn)及濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料及動(dòng)物：人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品，澤瀉醇A-24-醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品由成都MUST生物技術(shù)有限公司提供。9-HODE標(biāo)準(zhǔn)品由美國Sigma公司提供。地西泮標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物鑒定所提供。西洋參、澤瀉和薏苡仁由黑龍江省世一堂中藥飲片廠提供。氮?dú)庥晒枮I春霖氣體有限公司提供。安捷倫6460三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜由美國Agilent公司提供。渦旋混合儀由美國Scientific公司提供。5810R離心機(jī)由德國Eppendorf AG公司提供。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買清潔級Sprague-Dawley(SD)3月齡雄性大鼠42只，且體質(zhì)量約為200g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：SCXK(黑)2013-004。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，房間溫度在20℃左右，相對濕度50%左右。

2.花旗澤仁水煎液，儲備液及工作液的制備：花旗澤仁水煎液按本課題組前期工作方法制備[13]。于25ml容量瓶中放置地西泮5mg，并甲醇進(jìn)行溶解，所配得內(nèi)標(biāo)儲備液的濃度為200μg/ml。分別精密稱取澤瀉醇A-24-醋酸酯、人參皂苷Rb1與9-HODE 0.4mg、4mg、2mg，繼續(xù)用甲醇溶解，分別制得濃度為40μg/ml、400μg/ml、200μg/ml的儲備液。用甲醇配制工作液：人參皂苷Rb1：1、2、4、10、20、40、100、200μg/ml；澤瀉醇A-24-醋酸酯：0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4μg/ml；9-HODE：0.2、0.4、1、2、4、10、20、40μg/ml。

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線組織樣品及質(zhì)量控制樣品的配制：工作溶液濃度為：人參皂苷Rb1為0.05～10.00μg/ml；澤瀉醇A-24-醋酸酯為0.001～0.200μg/ml；9-HODE為0.01～2.00μg/ml。質(zhì)量控制樣品濃度為：人參皂苷Rb1為 0.1、1、8μg/ml；澤瀉醇A-24-醋酸酯為 0.002、0.02、0.16μg/ml；9-HODE為0.02、0.2、1.6μg/ml。

4.液相色譜及質(zhì)譜檢測條件：液相色譜柱為C18柱(1.8μm，100.0mm×3.0mm)，其流速為0.3ml/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣體積為10μl，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃。流動(dòng)相：A相為水(含0.1%甲酸)，B相為乙腈。各個(gè)樣品的分析周期為12min，人參皂苷Rb1與澤瀉醇A-24-醋酸酯洗脫方式為梯度洗脫詳見表1，各待測成分的質(zhì)譜參數(shù)詳見表2。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

表2 待測成分的質(zhì)譜檢測參數(shù)

5.人參皂苷Rb1，澤瀉醇A-24-醋酸酯及9-HODE組織樣品處理方法：精密稱取脂肪組織樣品0.5g，加入0.9%氯化鈉注射液超聲10min進(jìn)行組織勻漿制備。將100μl組織勻漿準(zhǔn)確加入500μl含內(nèi)標(biāo)(地西泮為0.1μg/ml)的甲醇溶液，12000r/min高速離心10min，在30℃氮?dú)饬飨聦⑸锨逡捍蹈桑Ｓ鄽堅(jiān)尤爰状?00μl，高速離心10min復(fù)溶。

6.組織樣品方法學(xué)考察：(1)選擇性：選取脂肪組織樣品，加入混合標(biāo)準(zhǔn)樣品制成濃度為人參皂苷Rb1：1μg/ml；澤瀉醇A-24-醋酸酯：0.2μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)添加組織樣品。另取空白脂肪組織配制成9-HODE濃度為0.02μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)添加組織樣品，并與空白組織一同處理進(jìn)樣分析。(2)線性范圍和定量下限：將人參皂苷Rb1與澤瀉醇A-24-醋酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)曲線組織樣品及9-HODE標(biāo)準(zhǔn)曲線組織樣品分別進(jìn)樣分析，獲得待測組分與內(nèi)標(biāo)峰面積值。縱坐標(biāo)(y)：人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯峰面積與內(nèi)標(biāo)物地西泮峰面積做比，橫坐標(biāo)(x)：標(biāo)準(zhǔn)組織樣品濃度。另外，以縱坐標(biāo)為9-HODE峰面積，以橫坐標(biāo)為9-HODE標(biāo)準(zhǔn)組織樣品濃度。(3)基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率：將配制好的質(zhì)量控制脂肪組織樣品進(jìn)行進(jìn)樣分析，待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積A3。組織樣品處理后，分別加入與質(zhì)量控制樣品同等濃度的人參皂苷Rb1、澤瀉醇A-24-醋酸酯與內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及9-HODE標(biāo)準(zhǔn)溶液，峰面積A2。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與9-HODE標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣分析，得到峰面積A1。(4)精密度和準(zhǔn)確度：將配制好的質(zhì)量控制脂肪組織樣品分別按照組織樣品處理方法進(jìn)行進(jìn)樣分析，得到3種待測組分及內(nèi)標(biāo)峰面積值，求算組織樣品日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度。連續(xù)3天進(jìn)樣分析，求算組織樣品日間精密度和準(zhǔn)確度。(5)樣品穩(wěn)定性：反復(fù)凍融3次后進(jìn)樣分析；于25℃室溫下放置4h后進(jìn)樣分析；2周后進(jìn)行進(jìn)樣分析；于自動(dòng)進(jìn)樣器12h后進(jìn)樣分析。

結(jié) 果

1.方法學(xué)考察：選擇性如圖1～圖2為待測組分與內(nèi)標(biāo)色譜圖結(jié)果，結(jié)果顯示在待測組分和內(nèi)標(biāo)的出峰位置，空白各組織勻漿中的其他內(nèi)源性成分對測定不造成干擾。待測組分和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間如下：人參皂苷Rb1保留時(shí)間為 6.2min，澤瀉醇A-24-醋酸酯保留時(shí)間為9.4min，地西泮保留時(shí)間為1.7min，9-HODE的保留時(shí)間為2.7min。

圖1 組織樣品色譜圖

圖2 9-HODE的組織樣品色譜圖

2.線性范圍與定量下限：標(biāo)準(zhǔn)曲線在各濃度范圍內(nèi)均顯示線性良好，人參皂苷濃度為Rb1：0.05～10.00μg/ml；澤瀉醇A-24-醋酸酯濃度為0.001～0.200μg/ml；9-HODE濃度為0.01～2.00μg/ml。待測組分的平均回歸方程詳見表3。

表3 待測組分在脂肪組織中的平均回歸方程、相關(guān)系數(shù)與定量下限(n=6)

3.基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率：低、中、高3個(gè)濃度下，3種活性成分均存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，均為85%～115%，且精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<20%，符合生物樣品分析要求。提取回收率結(jié)果顯示，3種待測組分結(jié)果均在80%左右。組織處理方法對待測組分提取回收率良好，重現(xiàn)性均較好，均符合分析要求(表4)。

表4 待測組分在大鼠脂肪組織中的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

4.精密度和準(zhǔn)確度：3種待測組分在脂肪組織中的日內(nèi)與日間精密度均<20%，日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度為±20%，數(shù)據(jù)表明待測組分在大鼠各組織中的精密度與準(zhǔn)確度符合生物樣品的分析要求(表5)。

表5 待測組分在大鼠脂肪組織中的精密度和準(zhǔn)確度(n=6)

5.樣品穩(wěn)定性：低、中、高3個(gè)濃度下，相對偏差均為±20%，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<20%，待測組分在大鼠脂肪組織中的穩(wěn)定性符合生物樣品的分析要求(表6)。

表6 待測組分在大鼠脂肪組織中的穩(wěn)定性(n=6)

6.花旗澤仁主要活性成分在大鼠胰島素抵抗脂肪組織中的分布結(jié)果與特點(diǎn)：大鼠灌胃給予花旗澤仁水煎液0、0.25、0.5、1、2、6和8h后，花旗澤仁3種主要活性成分在脂肪組織中的濃度詳見表7。人參皂苷Rb1在給藥后在脂肪組織中分布較慢，給藥后1h內(nèi)脂肪中未發(fā)現(xiàn)分布或分布較少。人參皂苷Rb1在給藥6h后，于脂肪組織中濃度最高。澤瀉醇A-24-醋酸酯進(jìn)入脂肪組織的速度較快，給藥8h后于在脂肪組織中檢測濃度相對較高。9-HODE脂肪組織中分布較多，大鼠口服花旗澤仁水煎液后脂肪組織中9-HODE的含量均出現(xiàn)了不同程度的增加，便于其在胰島素抵抗相關(guān)組織中發(fā)揮作用，同時(shí)隨著體內(nèi)代謝與排泄過程，9-HODE含量逐漸降低并趨于基礎(chǔ)值(圖3～圖5)。

表7 大鼠口服花旗澤仁水煎液后待測組分在脂肪組織中的濃度(μg/g)

圖3 大鼠口服花旗澤仁水煎液后人參皂苷Rb1在脂肪組織的分布

圖4 大鼠口服花旗澤仁水煎液后澤瀉醇A-24-醋酸酯在脂肪組織的分布

圖5 大鼠口服花旗澤仁水煎液后9-HODE在脂肪組織的分布

討 論

Xiong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射人參皂苷Rb1后，能顯著降低高脂飲食大鼠的空腹血糖，提高糖耐量，表明人參皂苷Rb1能有效維持血糖穩(wěn)態(tài)。Yu等[15]報(bào)道人參皂苷Rb1通過上調(diào)肝脂蛋白的表達(dá)，降低了db/db小鼠肝臟脂質(zhì)外區(qū)的堆積。此外，人參皂苷Rb1還可以有效降低血液中的游離脂肪酸，提高胰島素敏感度。本實(shí)驗(yàn)將花旗澤仁水煎液給與大鼠后，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1分布速度略慢，2h后在脂肪組織上的分布增加，且6h后分布最多。

澤瀉在我國醫(yī)學(xué)中已被用于糖尿病的治療。體外實(shí)驗(yàn)顯示其降血糖活性。測定3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖和脂質(zhì)水平，分析α-葡萄糖苷酶的抑制作用。與抗糖尿病藥物噻唑烷二酮類比較，0.5g/kg劑量的澤瀉乙醇提取物在3T3-L1脂肪細(xì)胞模型中增加了葡萄糖攝取而不是脂肪生成，同時(shí)在25μg/ml劑量下抑制了α-葡萄糖苷酶活性。實(shí)驗(yàn)給予花旗澤仁后，澤瀉醇A-24-醋酸酯進(jìn)入脂肪組織速度較快，且1h后隨著時(shí)間增加分布增多，給藥8h后于在脂肪組織中檢測濃度相對較高。

Liu等[16]使用高脂肪飲食(HFD)誘導(dǎo)小鼠肥胖，并檢測薏苡仁(CS)治療對微生物組成和功能的調(diào)節(jié)。研究表明，CS引起的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與抗肥胖和抗糖尿病作用有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明大鼠口服花旗澤仁水煎液后脂肪組織中9-HODE的含量均出現(xiàn)了不同程度的增加，同時(shí)隨著體內(nèi)代謝與排泄過程，9-HODE含量逐漸降低并趨于基礎(chǔ)值。

綜上所述，3種活性成分在胰島素抵抗相關(guān)組織——脂肪中均有分布，有利于其在治療2型糖尿病胰島素抵抗的過程中發(fā)揮藥理作用。