TENM4 基因rs4483616 位點多態性與江西省漢族人群免疫性血小板減少癥的相關性研究

趙 翠 徐顏美 楊文濤 李 靜 黃 波 劉 靜 林 晉 楊偉明 張 靜 王小中

免疫性血小板減少癥(immunethrombocytopenia，ITP)是一種獲得性自身免疫性疾病，其特點為體內血小板產生減少和破壞過多，循環血小板數量顯著減少，出血風險增加[1,2]。目前認為 ITP主要由細胞和體液免疫因素導致[3]。近年來，研究者認為遺傳因素在 ITP 發生、發展過程中起重要作用，且通過多種遺傳學分析手段發現多種基因多態性可能是 ITP發生的易感因素[3～5]。筆者團隊前期通過全基因組關聯研究(genome-wideassociationstudy，GWAS)發現TENM4 rs4483616(P=0.000)與中國江西省漢族人群顯著相關,因當時技術問題無法合成探針引物,故未對其進行基因分型[6]。本研究將完善前期實驗,采用 TaqMan 法檢測TENM4基因rs4483616 位點基因型，探討其基因型及等位基因頻率分布與 ITP 的易感相關性。

材料與方法

1.研究對象:于2015年6月～2018年10月，納入于筆者醫院血液內科就診并符合《成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版)》診斷標準的成人 ITP 患者 200 例為病例組[7]。本研究排除了招募家族性 ITP 病例。另外，排除其他類型的血小板減少，如肝素誘導的血小板計數減少或藥物誘導的血小板計數減少。同期收集于筆者醫院體檢的180例性別、種族等相匹配的健康受試者為對照組。同時，收集所有受試者的臨床基本資料。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經南昌大學第二附屬醫院醫學倫理學委員會審批。

2.儀器與試劑:LineGene 9600 實時熒光定量 PCR 儀(杭州博日科技有限公司)，K960 PCR 儀(力新儀器有限公司)，MINIP-2500 微孔板離心機(杭州米歐儀器有限公司)，Theromo NanoDrop 2000C 紫外/可見分光光度定量儀(中國賽默飛世爾科技有限公司)，PCR 引物、血液基因組柱式提取試劑盒、探針(北京Tsingke 公司)，滅菌水(實驗室自備)。

3.基因組 DNA提取及檢測:收集 ITP 患者及健康對照者 EDTA-K2 抗凝全血 3～4ml。根據 Tsingke 公司的基因組提取試劑盒說明書，從 200 例病例和180例對照中提取外周血白細胞的基因組 DNA。使用 Theromo NanoDrop 2000C 紫外/可見分光光度定量儀器計算DNA 濃度和純度，選擇濃度和純度合格的基因組 DNA 樣品，以進一步進行基因分型檢測。

4.探針及引物序列：rs4483616的引物及探針由 Tsingke 公司設計合成，具體序列如下：上游引物：5′-TCATGCTTTCCCTCCGTGG-3′，下游引物：5′-TCAGCTGAGGGTCAGGGAT-3′；探針1：5′-TGGATCCACTCTAAG-3′，探針2：5′-ATCCACTCCAAGAC-3′。PCR總反應體系為 20μl，反應條件為 95℃ 2min，95℃ 10s，60℃ 35s，共40個循環。反應在 LineGene9600 實時熒光定量 PCR儀(杭州博日科技有限公司)進行，利用Genotyper軟件進行基因分型檢測。

結 果

1.一般臨床特點:本研究招募的所有 ITP 患者均表現出相似的典型癥狀和體征。各受試者之間無血緣關系，無其他遺傳性疾病，均為江西省漢族人群。病例組與對照組受試者的年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)，所有受試者的一般臨床特征詳見表1。

表1 病例組與對照組的一般臨床資料

2.Hardy-Weinberg平衡檢驗結果結果：患者和對照組人群 rs4483616 位點的基因型頻率處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。本研究招募的人群來自遺傳平衡群體，詳見表2。

表2 基因型頻數分布的 Hardy-Weinberg平衡檢驗

3.rs4483616位點等位基因的探針分型結果:rs4483616位點具有兩種等位基因分別是C和T，共3種基因型分別是CC、CT和TT。本實驗分型結果顯示病例組CC型196例，CT型4例，TT型0例；對照組CC型166例，CT型14例，TT型0例。實驗結果與人類基因組計劃(HapMap)公布的中國北京人的 SNP 分型數據一致。

4.rs4483616位點基因型頻率和等位基因頻率與 ITP 的關系:ITP病例組rs4483616位點CC、CT和TT基因型頻率分別為98.0%、2.0%和0，對照組的基因型頻率分別為92.2%、7.8%和0。rs4483616位點與ITP疾病的發生存在一定的風險(OR=4.133,95% CI:1.335～12.796)，該位點的基因型頻率在兩組間比較，差異有統計學意義(χ2=7.009，P=0.008)，其中CC基因在病例組分布頻率高于對照組(P<0.05)(表3)。在ITP病例組和對照組中等位基因C的頻率分別為99.0%和96.1%，等位基因T在ITP病例組和對照組中的頻率分別為1.0%和3.9%。兩組人群間等位基因頻率差異有統計學意義(χ2=6.839，P=0.009)。ITP疾病組中C等位基因頻率與對照組比較，OR=4.006(95% CI：1.799～8.918)；T等位基因頻率與對照組比較，OR=0.292(95% CI：0.131～0.649，表4)。

表3 rs4483616 位點基因型頻率分布及其與ITP的關系基因型[n(%)]

表4 rs4483616位點等位基因頻率分布及其與ITP的關系

討 論

SNP是人類遺傳變異中最常見的類型，在人類基因組中廣泛存在。已有多項研究報道了基因的SNP與ITP的發生相關[4,8～10]。TENM4基因位于11號染色體上，含有34個外顯子，編碼一個由2769個氨基酸殘基組成的蛋白質。到目前為止，該基因的分子功能尚未明確。它可能是一種Ⅱ型跨膜蛋白，具有細胞信號轉換器的功能[11]。Park等[12]研究了TENM4基因多態性在高血壓患者中的易感性，發現TENM4 rs10466739與高血壓呈正相關。近年來有報道TENM4基因變異與常染色體顯性遺傳的原發性震顫、雙相情感障礙有關[13,14]。精神分裂癥具有高度的遺傳異質性，TENM4基因是精神分裂癥的候選基因[11]。眾所周知，許多遺傳性疾病有相似的潛在病因，并有共同的易感基因。筆者團隊前期通過GWAS篩選出TENM4基因rs4483616位點與中國江西省漢族人群顯著相關，可能是ITP的易感基因位點[6]。因此本研究進一步探究TENM4基因rs4483616位點基因型及等位基因頻率分布與ITP的易感相關性。

目前國內外尚無TENM4基因多態性與ITP的關聯性研究。本研究結果顯示TENM4基因rs4483616位點單核苷酸多態性的基因型頻率都達到遺傳平衡，具有群體代表性。ITP病例組rs4483616位點CC基因型頻率(98.0%)高于對照組(92.2%)，而且兩組間rs4483616位點的等位基因頻率及基因型頻率的差異有統計學意義(P<0.05)。ITP病例組中C等位基因頻率與對照組比較，OR=4.006(95% CI：1.799～8.918)；T等位基因頻率與對照相比較，OR=0.292(95% CI：0.131～0.649)，提示C等位基因可能是ITP發病的危險等位基因，T等位基因可能是ITP發病的保護等位基因。研究表明，TENM4基因rs4483616位點可能是江西省漢族人群ITP的易感基因位點。

本研究尚有不足之處，由于研究樣本量有限，研究對象種族、地域局限，因此研究中觀察到的結果有待于擴大樣本量予以進一步證實。需要從不同地域、不同種族及人種分析研究TENM4基因多態性與ITP易感性之間的關聯，同時聯合其他ITP易感基因，以提高個體ITP病易感性的預測水平，篩選出高危人群，從而加強ITP的早期預防、診斷及治療。