利福平對恥垢分枝桿菌基因的調控

劉 通，楊 麗，陳 贏，唐 靜，林 源，馬國榮，楊延輝

（寧夏醫科大學基礎醫學院，銀川 750004）

結核?。╰uberculosis，TB）是一種慢性傳染性疾病，亦是全球十大死亡原因之一。它的病原體是結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）。2019年世界衛生組織發布的TB報告顯示，全球約25%的人口曾感染過MTB，每年約有1000萬人患TB，約145萬人死亡[1]。如果診斷及時，用一線抗結核藥物經過6個月的治療，大多數肺結核患者可以治愈，但耐藥TB仍然是嚴重的公共衛生問題。2017年新發TB患者對利福平（rifampin，RIF）耐藥人數達55.8萬，其中82%發展為耐多藥結核病（MDR-TB）[2-4]。傳統認為RIF的耐藥基因主要為rpoB、rpoC、rpoA及rpoZ，但耐藥形成的分子機制報道較少[5-9]。本文用Illumina HiseqTM3000高通量測序平臺對1/2最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的RIF處理前后MS MC2155的總RNA進行測序，通過比對篩選獲得差異表達基因（difference expressed gene，DEG），并對DEG的功能進行聚類富集分析發現，使用RIF后能調控分枝桿菌萬古霉素耐藥、氧化磷酸化和共生體調節的關鍵基因，為進一步探討RIF耐藥機制的形成過程及尋找潛在的新型抗耐藥MTB的靶標奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基及主要試劑

MS MC2155由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所肖春玲研究員惠贈。7H9、7H10培養基、OADC（美國BD公司）；RIF、刃天青（北京博奧拓達科技有限公司）。

1.2 主要儀器

37℃培養箱（上?，槴\實驗設備有限公司，HF240）；酶標儀（Thermo Scientific-Multiskan GO）；紫外分光光度計（上海光明電子儀器廠，721型）；臺式高速冷凍離心（德國Eppendorf公司，5424 R）；生物安全柜（Heal Forec力康生物技術有限公司，900B2）；高壓滅菌鍋（Tomy Digital Biology公司，SX-500）；核酸電泳儀和紫外切膠儀（北京六一儀器廠，WD-9403F）；恒溫搖床（上海旻泉儀器有限公司，LPL-24）；核酸凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司，Gel DocTMXR+）。

1.3 刃天青法測定RIF對MS MC2155的MIC

MS MC2155菌株于7H10培養基中劃線涂板，37℃溫箱培養72 h，挑取單克隆接種于5 mL 7H9培養基中，在37℃、200 r·min-1的搖床中，培養至對數生長期。用分光光度計測得OD600=0.68。將MS MC2155菌液按1∶1000的比例稀釋于7H9培養基中。取兩個96孔板，在其最外一周各孔加入100μL的7H9培養基，在兩個96孔板的B2、F2孔各加2.56μL的RIF（濃度10 mg·mL-1）和187.44μL稀釋后的菌液，并吹打混勻，其余各孔均加入90μL稀釋后的菌液，取B2混合液100μL于B3孔吹打混勻，再取B3混合液100μL于B4孔吹打混勻，依此類推，B11中棄去100μL；F行方法同B行。加樣完成后將96孔板放入37℃恒溫箱孵育24 h后取出，在每孔中均加入10μL 10%的刃天青，再次放入37℃恒溫箱孵育6 h，取出觀察、拍照并用酶標儀測定。

1.4 用1/2 MIC濃度的RIF處理MS MC2155后制備RNA-seq樣品

挑取MS MC2155單克隆接種于5 mL 7H9培養基中，37℃，200 r·min-1振蕩培養72 h。取上述0.2 mL菌液分別接種于4瓶200 mL的7H9培養基中，在其中3瓶中各加入80μL濃度10 mg·mL-1的RIF儲存溶液，并用相同體積的DMSO溶液設立空白對照組，依照上述方法平行實驗3次，于37℃，200 r·min-1搖床中振蕩培養72 h。5000×g離心10 min，收集菌泥凍存于-80℃環境。

1.5 提取MS MC2155菌株的總RNA

用Trizol（TaKaRa，T9108）試劑提取細菌的總RNA，并用DNaseI（TaKaRa，D2215）去除樣品中的DNA。分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop（Agilent Technologies，美國）檢測RNA質量和完整性，使用QubitR 2.0 Flurometer（Life Technologies，美國）測定總RNA濃度。

1.6 構建cDNA文庫并測序

將得到的總RNA進行反轉錄一鏈的合成，隨后進行反轉錄二鏈的合成和末端修復。在末端修復產物cDNA的3'末端加堿基A，加測序接頭。鏈接產物經膠回收后進行PCR反應及產物回收。文庫構建完成后，分別使用QubitR2.0和Agilent 2100對文庫的濃度和插入片段大小進行檢測，使用q-PCR法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。建好的文庫采用Illumina 3000測序平臺，2×151測序模式進行測序。

1.7 組裝測序數據并注釋基因功能

利用FPKM（Fragments Per Kilobase per Million reads）方法計算基因的表達量，利用DESeq2軟件針對有重復樣本的不同樣本組之間篩選差異表達基因，利用DESeq 2軟件針對無重復樣本的不同樣本組之間篩選差異表達的已知基因，以|log2FC|≥1和P≤0.05為閾值，篩選兩組之間的差異基因。

1.8 差異表達基因的GO和KEGG功能富集分析

把所有得到的差異表達基因和背景基因映射到GO數據庫（http://www.geneontology.org），計算每個條目的基因數目，采用超幾何檢驗方法得到P值，并將差異基因進行GO注釋，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO條目。以P≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異表達基因中顯著富集的GO term。通過GO功能顯著性富集分析確定差異表達基因行使的主要生物學、細胞、分子功能。并將差異表達基因序列在KEGG數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）中進行注釋，同樣的方法得到P值。以P≤0.05為閾值，通過pathway分析確定差異表達基因的顯著性富集通路。

1.9 核心DEG的互作分析

利用在線數據庫STRING（http://string-db.org）篩選存在蛋白互作網絡（Protein-Protein Interaction，PPI）的DEGs。利用Cytoscape軟件（http://www.cytoscape.org/）構建蛋白質互作關系網絡，并進一步分析候選DEGs編碼蛋白在MS MC2155中的相互作用關系。

2 結果

2.1 RIF對MS MC2155的MIC

使用刃天青法經過3次生物學重復，測得RIF對MS MC2155菌株的MIC值為8μg·mL-1。分別使用4、6μg·mL-1的RIF培養MS MC2155菌株，發現6μg·mL-1的RIF導致細菌生長速度極慢，樣品量不足，最終確定RNA-seq的藥物處理濃度為4μg·mL-1。

2.2 RNA質量和完整性

圖1顯示出三條清晰的條帶、無雜帶、無拖尾或彌散現象，說明RNA樣本其大小和條數有物種特異性，無降解情況，不含其他雜質，OD260/OD280=2.13，滿足測序要求。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 測序數據質量與評估

表1是MS MC2155與RIF處理后MC2155的原始序列和預處理序列的統計結果和Reads的參考基因組比對分析統計結果；CGC1~3是指MS MC2155樣品名稱，CGL1~3是指RIF處理后MS MC2155樣品名稱。利用FastQC軟件對預處理數據進行質量控制分析，結果顯示測序樣品Q20的質量值為97.79%~98.85%，滿足進行后續數據分析的標準。

表1 樣品質量檢測（%）

2.4 DEGs表達水平比對分析結果

對RIF處理后的MC2155與野生型差異表達結果分析如圖2所示，A為差異基因火山圖，B為差異基因散點圖。共832個基因的表達水平差異有統計學意義（P≤0.05，|log2FC|≥1），其中457個上調，375個下調。差異倍數在10倍以上的基因有76個，其中41個下調，35個上調。差異基因主要集中在萬古霉素耐藥、氧化磷酸化及氮代謝等通路中，其中萬古霉素耐藥差異表達基因有190個，氧化磷酸化差異表達基因有23個，氮代謝差異表達基因有9個。表2為差異倍數在10倍以上的部分DEGs，其中nrdB、mysB、ruvC、proW、sigM和cspA屬萬古霉素耐藥通路相關基因；nuoF和nuoB屬氧化磷酸化通路相關基因。

圖2 RIF處理MC2155后的差異表達基因分析

2.5 GO和KEGG功能富集分析結果

對RIF處理后的恥垢分枝桿菌差異表達基因進行GO富集分析（圖3）。在GO數據庫中，表達基因根據功能分為生物學過程（biological process），細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）三大類，其中氧化還原酶活性、呼吸鏈復合物等分子功能以及外來生物刺激、共生體調節等生物學過程是差異表達基因最多的路徑。對RIF處理后的恥垢分枝桿菌差異表達基因進行KEGG富集分析（圖4）。結果表明，差異表達基因主要集中在萬古霉素耐藥（vancomycin resistance）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）通路。

表2 利福平處理后的主要差異基因

圖3 RIF處理MS MC2155后的差異表達基因GO富集柱狀圖

圖4 KEGG差異表達基因富集

2.6 核心DEG的互作分析結果

STRING分析結果顯示，共有371個差異基因編碼的蛋白質存在相互作用，圖5A為其中50個中心節點基因。圖5B為差異倍數在10倍以上且存在互作關系的典型基因，其中MS0559為cspA。這些基因的異常表達可能在利福平調控中具有重要作用。

圖5 顯著差異基因所表達蛋白的互作分析

2.7 nrdB提示RIF治療結核的可能機制與潛在耐藥靶標

STRING檢索發現顯著差異基因sigM、mysB和rplM確與rpoB存在密切關聯（圖6A），但RIF處理后分枝桿菌nrdB基因表達量降低超過16倍，gmk和guaB等核苷酸代謝相關基因表達同樣顯著降低，這說明RIF可能通過降低nrdB的表達來抑制核苷酸轉化為脫氧核糖核苷酸，減少DNA合成所需原料，從而直接阻斷分枝桿菌DNA及蛋白的合成。且STRING檢索表明nrdB、gmk和guaB存在明顯互作關系（圖6B）。提示nrdB可能是一個全新的RIF治療及耐藥關鍵靶點。

3 討論

TB治療的難題在于日益嚴重的TB耐藥性，然而常用一線抗結核藥物RIF的耐藥基因是如何形成的尚不明了[10-11]。在分枝桿菌的作用機制研究中，MS與MTB的基因同源性高，生長速度快，生物安全要求低，在新型藥物開發和耐藥機制研究方面是MTB研究的理想模式菌之一[12-13]。RIF是首選的一線抗結核藥物，臨床中常采取聯合用藥的方式加強療效，也同時避免單用易產生耐藥性的問題[3，14-15]。轉錄組測序（RNA-seq）指利用高通量測序技術，在轉錄組水平上進行深度測序的一項技術。它能從整體水平上更加全面地揭示藥物干預后細菌為適應環境所發生的基因轉錄水平的變化，有利于篩選發現RIF干預MS后所調控的基因[16-18]。

圖6 RpoB和nrdB相關蛋白網絡關系

有研究結果顯示，RIF耐藥的分子機制涉及多個生物合成網絡和途徑中的多個基因[19-20]。RIF的作用機制目前認為是RIF與依賴DNA的RNA多聚酶的β亞單位牢固結合，阻斷RNA轉錄過程，使DNA和蛋白的合成停止；RIF還可以通過抑制酪氨酸酶活性來抑制細菌的生長[21-23]。RpoB是一種DNA依賴的RNA聚合酶，nrdB是一種核糖核苷二磷酸還原酶。RIF通過與rpoB結合，干擾DNA轉錄和RNA延伸，從而抑制分枝桿菌生長；而RIF耐藥也與rpoB結合位點突變密切相關[21-23]。目前認為rpoB基因突變是RIF耐藥的主要原因，其中最常見的突變密碼子是531、526和516[22]。但在耐藥基因的發生和發展方面尚無更全面的整體性研究。

本研究首次使用RIF在模式菌MS MC2155構建了細菌的RNA-seq cDNA文庫，經全轉錄組分析發現了cspA、sigM、nrdB、nuoF、nuoB和mysB等表達水平差異較大的基因，與已知的耐藥基因rpoB、rpoC、rpoA及rpoZ等完全不同。通過同MS MC2155的參考基因預測發現RIF有類似于萬古霉素的作用機制。研究表明，本文篩選得到的nrdB可與nrdA共同催化核糖核苷酸還原成相應的脫氧核糖核苷酸，該基因的低表達可直接影響細菌DNA的合成[24]；nuoF和nuoB同屬醌氧化還原酶亞基，均為NDH-1的外圍臂組成部分，在NDH-1的結構穩定性中起關鍵作用，該基因的低表達可直接影響NADH脫氫酶片段的組裝，引起分枝桿菌的能量傳遞紊亂[25-27]；sigM屬于RNA聚合酶因子，能調節Esx分泌的蛋白質和非核糖體肽合成酶基因，并向下調節與毒力相關的表面脂質合成，該基因的高表達可降低分枝桿菌毒性[28-30]；cspA屬于冷休克蛋白，能調控細菌對低溫的適應、影響細胞壁結構的形成以及調控RIF的藥敏，研究表明，結核分枝桿菌的cspA是一種分泌蛋白，能引起細胞免疫，是一種可能的T細胞抗原[31-33]。以上新的關鍵基因的獲得為研究RIF影響分枝桿菌所涉及的早期調控分子機制提供了全新的靶標分子。