CYP11B2基因-344C/T位點多態性在云南彝族人群中的分布

彭紅瑜 范志祥 張延潔 舒 芯 張馥麟 龍 莉

醛固酮合成酶(CYP11B2)基因位于8號染色體長臂2區4帶(8q24.3)，負責編碼的醛固酮合成酶屬于細胞色素P450超家族的一員，位于線粒體內膜，具有18-羥化酶、11β-羥化酶和18-氧化酶活性[1]。CYP11B2是合成醛固酮最后階段的關鍵限速酶，而醛固酮是人體中最重要的鹽皮質激素，是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的重要組成部分[2]。多項研究發現CYP11B2基因啟動子區域的-344 C/T(rs1799998)多態性，2號內含子轉換多態性，3號外顯子K173R多態性等突變會影響CYP11B2基因功能，CYP11B2基因啟動子區域-344C/T多態性會影響其與轉錄調節因子SF-1的結合，-344C與SF-1的結合率比-344T高4倍[3～5]。CYP11B2基因-344C/T位點的突變所引發的醛固酮合成水平失調會導致體內水鈉滯留，與機體多種疾病例如女性子癇、原發性及繼發性高血壓、肥胖、腎病等密切相關，CYP11B2基因多態作為國內外心血管及腎臟疾病中的研究熱門，在多個國家不同民族不同人種中均有數據[6～11]。本研究探討了CYP11B2基因-344C/T位點在云南省少數民族彝族人群中的多態分布以及與其他民族、國家人群對比的結果是否具有特異性，為研究CYP11B2基因相關疾病的發病機制奠定基礎。

資料與方法

1.研究對象：本研究樣本均來自云南省昆明市晉寧縣雙河鄉居民，所有入選者均為當地彝族，年齡為7～84歲，無異族通婚史，排除肝臟、腎臟、甲狀腺功能異常，高血壓和其他心血管疾病，最終入選286例，其中男性88例，女性198例。本研究經昆明醫科大學醫學倫理學委員會批準，本項研究入選者均已知情并同意。

2.研究方法：取EDTA抗凝處理后的測試者外周血，采用酚-氯仿法提取基因組DNA，置于-20℃備用。以該DNA樣品作為模板，采用PCR-RFLP技術特異性擴增目的基因片段，上游引物序列如下：5′-CAG GAG GAG ACC CCA TGT GAC-3′，下游引物序列如下：5′-CCT CCA CCC TGT TCA GCC C-3′。使用1.1x T3 Super PCR Mix(北京擎科生物科技 TSE030)，按比例加入模板與引物配制成20μl PCR體系，設置PCR儀循環條件為：預變性98℃2min；變性98℃15s；退火58℃15s；延伸72℃30s，共進行38個循環；最后72℃延伸2min，4℃冰箱保存。PCR產物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，有目的條帶的PCR樣品繼續使用限制性內切酶HaeⅢ(美國Thermo Fisher Scientific公司)酶切，37℃水浴4h，酶切產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，Bio-Rad凝膠成像分析系統拍照并保存結果，使用Image-Lab軟件分析基因型。

3.統計學方法：分別計算CYP11B2基因-344C/T多態位點的基因型頻率和等位基因頻率，卡方檢驗檢測哈迪·溫伯格平衡及組間基因型、等位基因頻率，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.CYP11B2基因-344C/T位點多態性：PCR特異性擴增目的產物后，產生了一條長度為537bp的目的片段(圖1)，將擴增出目的片段的PCR產物繼續酶切，由于HaeⅢ的酶切位點為GGCC，而位于CYP11B2基因啟動子區域的-344位點(-GGCT)可發生胸腺嘧啶(T)與胞嘧啶(C)的互換，產生了能被切開的位點，經HaeⅢ內切酶消化后，等位基因T會產生273bp的片段，等位基因C則被切開產生202bp和71bp兩個片段，138bp和126bp為共有片段，故TT基因型的酶切結果為273bp、138bp和126bp 3個片段，CT型會產生273bp、202bp、138bp、126bp和71bp共5個片段，CC型會產生202bp、138bp、126bp和71bp共4個片段，由于71bp片段過小很難被瓊脂糖凝膠電泳檢測到，故膠圖中不展示71bp條帶(圖2)，由此可以清晰地鑒定出所有樣本的基因型。對所有樣品的基因型統計后進行哈迪·溫伯格平衡檢驗(χ2=0.341，P>0.05)。

圖1 CYP11B2基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 CYP11B2基因-344C/T位點基因型多態性

2.CYP11B2基因-344C/T位點多態性在云南省彝族人群中的分布：在云南省晉寧縣雙河鄉286例健康彝族人群中，基因型為TT的人數為171，基因型為CT的人數為97，基因型為CC的人數為18，各自的基因型頻率對應59.79%，33.92%及6.29%。通過計算可得T等位基因的頻率為76.75%，C等位基因的頻率為23.25%(表1)，男性和女性等位基因T/C分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 云南省彝族人群中CYP11B2基因-344C/T位點基因型及等位基因頻率[n(%)]

3.CYP11B2基因-344C/T位點多態性分布與其他人群的比較：云南省彝族人群中CYP11B2基因-344C/T位點的基因型分布與其在我國新疆維吾爾自治區哈薩克族、維吾爾族人群中的分布略有差異，與福建省、黑龍江省漢族人群比較差異無統計學意義。其中基因型TT在彝族人群中的分布(59.79%)顯著高于哈薩克族(10.75%)與維吾爾族(40.08%)(P<0.05),彝族人群中CT基因型(33.92%)則低于哈薩克族人群(51.47%)(P<0.05)，與維吾爾族人群比較差異無統計學意義(P>0.05)。等位基因T在彝族人群中的分布(77.27%)明顯高于哈薩克族(36.48%)和維吾爾族人群(61.71%)，等位基因C的頻率分布則較低(P<0.05)，詳見表2。

表2 CYP11B2基因-344C/T位點多態性在云南省彝族與其他人群中的分布[n(%)]

通過比較彝族與不同國家、不同種族的人群得出以下差異，例如彝族人群中CYP11B2基因-344C/T位點TT基因型(59.79%)顯著高于韓國人(44.03%)、土耳其人(19.17%)、法國白人(31.15%)、意大利白人(33.98%)、德國白人(22.7%)、印度白人(28.43%)與非洲突尼斯黑人(11.49%)(P<0.05)。而彝族人群中基因型CT頻率(33.92%)則較韓國人(47.76%)、土耳其人(57.5%)、法國白人(51.42%)、意大利白人(50.94%)及印度白人(49.49%)較低(P<0.05),與德國白人(43.56%)及非洲突尼斯黑人(40.77%)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。基因型CC頻率在彝族與韓國人群中較低，且兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)，彝族人群中基因型CC的頻率(6.29%)顯著低于土耳其人(23.33%)、法國白人(17.43%)、意大利白人(15.08%)、德國白人(33.74%)、印度白人(22.08%)及非洲突尼斯黑人(47.75%)(P<0.05)。比較等位基因T/C的分布頻率可知，在彝族人群和韓國人群中等位基因T/C的分布頻率較為接近(P>0.05),在土耳其人、法國白人、意大利白人、德國白人、印度白人及非洲突尼斯黑人中，等位基因T的頻率較低，等位基因C的頻率較高(P<0.01),詳見表2。

討 論

醛固酮主要作用于腎臟，是人體調節血容量的重要激素，通過調節腎臟對Na+的重吸收，維持水鹽平衡。當細胞外液容量下降時，刺激腎小球旁細胞分泌腎素，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統，醛固酮分泌增加，使腎臟重吸收Na+增加，進而引起水重吸收增加。近年來，作為醛固酮合成系統的關鍵基因，CYP11B2基因成為心血管疾病和腎功能異常的研究熱點。在土耳其居民中的一項研究發現，CYP11B2基因的多態性可能與當地居民的慢性腎病有關，在以韓國年輕人為調查對象的研究中也發現了CYP11B2基因與末期腎病的相關性[11，12]。另外，CYP11B2基因與疾病的相關性表現出民族和種族差異。周春龍等[6]研究發現CYP11B2基因與深圳地區漢族原發性高血壓相關，而趙平等[13]研究發現CYP11B2基因與我國錫林郭勒市蒙古族的原發性高血壓不相關。CYP11B2基因-344C/T位點多態性與東亞和南亞人群中腦卒中易感性表現出相關，但在高加索白人中差異無統計學意義，而在有關IgA腎病的研究中發現，CYP11B2基因-344C/T位點多態性的分布在中國黃種人中差異無統計學意義，卻影響高加索白人的患病風險[14～16]。

關于彝族人群中醛固酮相關疾病方面研究較少，徐洪呂等[17]研究證實彝族人健康成年人群中超重和肥胖率在我國處于中等水平，存在一定的健康隱患。同處云南省的南澗、漾溟和建水3個行政縣內的彝族人群高血壓發生率不同，建水縣最高，屬于高血壓高發人群，本研究涉及到的晉寧縣彝族人群則無相關研究數據[18]。

眾所周知,疾病的發生可能受到遺傳與環境因素的雙重作用，大多數疾病是多種基因共同參與調控的結果，所以在不同的遺傳背景下，同一疾病的易感基因可能會根據社會背景、民族及種族差異而發生改變，這些多樣化的結果可以更好地幫助了解基因突變所產生的多態性對機體或好或壞的影響，以便提前采取應對措施。已有研究證實彝族的一些基因多態分布具有民族特異性，例如CR1基因的Exon22(rs2274567),Intron27(rs11118133)和Exon33(rs3811381)位點，t-PA基因Alu重復序列I/D等[19～21]。

本研究CYP11B2基因-344C/T位點的多態性在云南省彝族人群中的分布以及與國內外不同民族、人種的比較發現，在彝族人群中TT基因型的分布頻率較高，等位基因T頻率也顯著較高，而CT及CC基因型頻率較低，對應的等位基因C的分布頻率也較低。與同屬中國少數民族的新疆維吾爾自治區哈薩克族與維吾爾族比較，彝族CYP11B2基因-344C/T多態位點的基因型頻率和等位基因頻率差異有統計學意義，揭示了該位點多態性分布的民族差異。在與土耳其、法國、意大利、德國、印度、非洲突尼斯等不同國家的白人或黑人人群比較發現，彝族CYP11B2基因-344C/T多態位點的基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統計學意義，說明不同人種之間該位點多態性分布也不相同[5,10～12,22,23]。該發現從分子流行病學角度驗證了CYP11B2基因-344C/T位點多態性在彝族人群中的民族特異性，為云南地區彝族人群心血管、腎臟疾病等CYP11B2基因相關疾病的研究提供了數據，今后還將在不同疾病中繼續探索CYP11B2基因不同突變位點的多態性與各人群之間的關系，為相關地區疾病防治提供新的思路。