外周血干細胞樣記憶性T細胞在腎癌患者中的表達水平及臨床意義

陳 婷 黃小雨 楊棟梁 孫方滸 蔣曉東

腎細胞癌簡稱腎癌，占全球惡性腫瘤的2%～3%，近年來世界范圍內的腎癌發生率呈上升趨勢[1]。腎癌早期臨床癥狀不明顯，大多數患者在健康體檢或其他影像學檢查時發現，約17%的患者在初次診斷時伴有遠處轉移，嚴重影響腎癌患者的生命健康[2]。腎癌是泌尿系統最致命的癌癥，其5年生存率僅為73%，而前列癌和膀胱癌的5年生存率分別是99%和77%[3]。近年來有關腎癌免疫原性特征的研究進展迅速，免疫療法在腎癌治療中展現出巨大的潛力[4,5]。個體化疫苗、程序性死亡分子-1(programmed death-1，PD-1)或程序性死亡分子配體-1(programmed death-ligand 1，PD-L1)抑制劑和嵌合抗原受體T細胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)等均是具有前景的治療方案[6,7]。這些治療的效果是由T淋巴細胞介導的，這表明T細胞和適應性免疫反應在機體抗腫瘤反應中起著至關重要的作用。

源自初始T細胞(naive T cells，TN)的干細胞樣記憶性T細胞(stem-like memory T cells，TSCM)是一個具有干細胞特征的記憶性T細胞(memory T cells，TM)亞群，能夠自我更新增殖和長期存活，在抗原再次刺激下，能快速做出免疫應答。有文獻報道TSCM在小鼠模型中具有很強的抗腫瘤作用，在過繼轉移治療宿主病的整個過程中持續存在，并具有持久存活和多向分化的能力[8]。目前，國內外對TSCM在腎癌中的研究報道較少。因此，本研究對腎癌患者外周血干細胞樣記憶性T細胞分布特征進行分析，探討TSCM與臨床病理特征的關系，同時期望為TSCM在腎癌中的研究提供新的見解，并有利于細胞免疫治療。

對象與方法

1.研究對象：選取2019年9月～2020年6月連云港第一人民醫院就診的病房腎癌患者65例為腎癌組，其中男性46例，女性19例，患者年齡30～78 歲，患者中位年齡為60歲；左側腎癌27例，右側腎癌38例；參照腎癌TNM分期系統：Ⅰ期32例，Ⅱ期10例，Ⅲ期14例，Ⅳ期9例；病理類型均為透明細胞癌。納入標準：①經組織學證實為腎癌；②未接受抗腫瘤的相關治療(免疫治療、靶向治療、手術治療等)；③不合并其他腫瘤及自身免疫性疾病；④自愿參加本研究并簽署同意書。同期選取筆者醫院健康獻血者30例為健康組，其中男性19例，女性11例，年齡33～72歲，中位年齡為52歲，所有研究對象簽署知情同意書。

2.主要試劑與儀器：人淋巴細胞分離液LymphoprepTM、含2% 胎牛血清的磷酸鹽緩沖液、SepMateTM-50試管購自加拿大Stemcell公司，鼠抗人CD3-APC-Cy7抗體、鼠抗人CD45RA-V450抗體、鼠抗人CD45RO-PE-Cy7抗體、鼠抗人CCR7-BV510抗體、鼠抗人CD95-BV605抗體購自美國Becton Dickinson公司，BD LSRF tessa流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

3.外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離：所有入組人群禁食6～8h，采集靜脈血5ml，肝素抗凝后采用SepMateTM-50試管按照說明書步驟通過密度梯度離心法從外周全血樣本中分離得到PBMC。

4.流式細胞術檢測外周血中TN、TSCM的表達水平：取200μl磷酸鹽緩沖液分別將各組的PBMC重懸，每組設anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD45RA-V450、anti-CD45RO-PE-Cy7、anti-CCR7-BV510、anti-CD95-BV605單標管和同型健康對照管，分別加入上述抗體及同型對照抗體，混勻，室溫避光。加入2ml磷酸鹽緩沖液洗滌，2000r/min，離心2min，棄去上清液，重復1次，取終濃度1%的多聚甲醛500μl制成單細胞懸液。采用BD LSRF tessa流式細胞儀，以CD3+CD45RA+CD45RO-CCR7+CD95-為TN表型，CD3+CD45RA+CD45RO-CCR7+CD95+為TSCM表型(圖1)。

圖1 腎癌患者外周血中TSCM和TN的流式細胞術二維點陣圖

結 果

1.腎癌組和健康組外周血中TSCM、TN及TSCM/TN表達水平比較：與健康組比較，腎癌組患者外周血中TSCM比例(0.15%±0.06% vs 0.20%±0.11%，t=2.524，P<0.05)和TN比例(2.66%±1.18% vs 6.29%±1.58%，t=12.499，P<0.01)均明顯降低，TSCM/TN值(6.48%±3.70% vs 3.31%±1.82%，t=5.600，P<0.01)明顯升高，詳見表1。

表1 腎癌組和健康組外周血中TSCM、TN及TSCM/TN表達水平比較

2.腎癌患者外周血TSCM、TN及TSCM/TN與臨床病理資料關系：與Ⅰ期+Ⅱ期腎癌患者比較，Ⅲ期+Ⅳ期患者外周血中TSCM比例(0.12%±0.04% vs 0.16%±0.06%，t=2.935，P<0.01)明顯降低。而TSCM比例水平與性別、年齡、病灶長徑、Fuhrman分級和有無被膜侵犯無關(P>0.05)。Ⅰ期+Ⅱ期患者和Ⅲ期+Ⅳ期患者外周血中TN比例分別為3.29%±0.91%、1.49%±0.53%，Ⅰ期+Ⅱ期患者TN比例高于Ⅲ期+Ⅳ期患者(t=10.039，P<0.01)；與Fuhrman分級G1+G2患者比較，G3+G4患者外周血中TN比例(1.97%±0.84% vs 2.88%±1.19%，t=2.854，P<0.01)明顯降低。而TN比例水平與性別、年齡、病灶長徑和有無被膜侵犯無關(P>0.05)。Ⅰ期+Ⅱ期患者和Ⅲ期+Ⅳ期患者外周血中TSCM/TN值分別為5.20%±2.38%、8.82%±4.51%，Ⅰ期+Ⅱ期患者TSCM/TN值低于Ⅲ期+Ⅳ期患者(t=3.583，P<0.01)。而TSCM/TN值水平與性別、年齡、病灶長徑、Fuhrman分級和有無被膜侵犯無關(P>0.05)，詳見表2。

表2 65例腎癌患者外周血TSCM、TN及TSCM/TN與臨床病理資料關系

3.腎癌患者外周血TSCM、TN及TSCM/TN與臨床病理特征相關性：TSCM比例與TNM分期(r=-0.258，P<0.05)、Fuhrman分級(r=-0.271，P<0.05)呈負相關；TN比例與TNM分期(r=-0.447，P<0.01)、Fuhrman分級(r=-0.263，P<0.05)呈負相關；TSCM/TN值與TNM分期(r=0.433，P<0.01)呈正相關，詳見表3。

表3 腎癌患者外周血TSCM、TN及TSCM/TN與臨床病理特征相關性

討 論

多數腎癌患者早期臨床表現不明顯，待出現血尿、腰痛、腫塊等癥狀時多已進展至晚期。惡性腫瘤的發生、發展一直處于機體的免疫監視之下，免疫系統包括組織免疫和細胞免疫，其中細胞免疫尤其是T淋巴細胞起著關鍵作用。T淋巴細胞是一個復雜的細胞亞群，機體在初次接觸抗原后，TN增殖分化為TM，最終分化為效應T細胞(effector T cells，Teff)。Hotta等[9]研究報道CD45RO+TM在腎癌患者的宿主防御中起著至關重要的作用，可作為免疫功能指標，具有獨立的預后判斷價值。TM可以根據細胞表面趨化因子受體(CCR7)和淋巴結歸巢分子(CD62L)分為典型的中央記憶性T細胞(central memory T cells，TCM)和效應記憶性T細胞(effector memory T cells，TEM)[10]。

隨著TSCM亞群的發現，傳統的T細胞線性分化模式被打破，T細胞分化模式改變為TN→Teff→TSCM→TCM→TEM→Teff[11]。TSCM具有的細胞特性使其在抗腫瘤的免疫反應中成為了研究熱點，但它在外周血中的比例很低[12]。Gattinoni等[8]研究表明對人外周血中TSCM表型進行鑒定，發現其與TN具有相似表面標志物CD62L，歸巢于次級淋巴結，發揮持久的免疫監視作用。同時，TSCM高表達干細胞相關表面標志物CD127，低表達與T細胞衰老細胞相關標志物CD57等，能夠長期在體內增殖存活，發揮抗腫瘤效應[12～14]。

TCSM具有很強的自我更新、增殖、多向分化和持久存活能力，在免疫細胞治療中具有重大應用前景。本研究發現，與健康組比較，腎癌組患者外周血中TSCM比例和TN比例均明顯降低，TSCM/TN明顯升高。腎癌患者荷瘤狀態下存在多種基因突變，機體免疫功能降低，TSCM及TN比例減少，在腫瘤抗原的刺激下，T淋巴細胞對腫瘤的免疫殺傷作用下降。王子文等[15]研究發現，胃癌患者中TSCM和TN與組織分化程度呈正相關，TN與腫瘤分期呈負相關，TSCM/TN值與腫瘤分期呈正相關，與本研究結果相似，腎癌患者TMN分期高(Ⅲ期+Ⅳ期)患者外周血中TSCM比例比TMN分期低(Ⅰ期+Ⅱ期)明顯降低，且與TNM分期、Fuhrman分級呈負相關；TMN分期低和核Fuhrman分級低(G1+G2)患者外周血TN比例均高于TMN分期高和核Fuhrman分級高(G3+G4)患者，且與TNM分期、Fuhrman分級呈正相關。腫瘤細胞分泌以及產生大量的免疫因子抑制TSCM等淋巴細胞的表達，造成細胞免疫功能紊亂，從而利于腫瘤的侵襲和轉移。本研究發現，TSCM/TN值在TNM分期高患者中明顯高于分期低的患者，且與TNM分期呈正相關。Wnt/β-catenin信號通路參與腎癌發生、發展的病理過程，Yan等[16]研究發現隨著腫瘤進展，通過抑制GSK-β磷酸化激活Wnt/β-catenin信號通路維持了較低分化的記憶T細胞，TSCM在TNM分期高的腎癌患者抗腫瘤效應中發揮重要作用。

過繼性免疫治療是對腎癌患者進行綜合治療的重要手段，將在體外擴增的具有抗腫瘤活性的細胞回輸患者體內發揮抗腫瘤作用[17～19]。過繼性免疫治療大多數基于終末分化效應T細胞，難以在體內發揮持久的抗腫瘤效應，而其抗腫瘤效應與回輸細胞的增殖和持久能力呈正相關[19]。因此，需要研究具有長期存活和自我更新能力的記憶淋巴細胞，為腎癌提供潛在的免疫治療策略。TSCM是一類具有干細胞特性的低分化早期T細胞亞群，并展示出顯著優于終末分化的效應T細胞的長期生存能力及抗腫瘤活性。TSCM所具有的特點，決定其在未來腎癌過繼性免疫治療領域中具有廣闊的應用前景，筆者推測TSCM的免疫監視能力可能受到某些促腫瘤因子的抑制，值得進一步研究。

綜上所述，腎癌患者外周血TSCM、TN及TSCM/TN值與腫瘤TNM分期和Fuhrman核分級密切相關，可用于評估腫瘤發生、發展情況，TSCM在腎癌的過繼性免疫治療中具有廣闊的應用前景。