內蒙古地區蒙古族兒童MPO基因與川崎病相關性研究

肖 蓉 常 鑫 陳麗清

川崎病(Kawasaki disease，KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，病因尚不明確，亞洲地區多見，好發于5歲以下人群。病變較為嚴重的是CAL，且兒童時期發生的冠狀動脈損害(CAL)可增加成年早期發生心肌缺血、冠狀動脈粥樣硬化的危險，因此KD所致CAL是目前臨床治療非常棘手的問題[1,2]。近年來，隨著KD發生率的上升，國內外各地流行病學調查數據均發現，KD的發生、發展，尤其是合并CAL，與其遺傳性及地區特異性有著較為密切的聯系。在遺傳性方面研究發現MPO基因不同位點基因多態性的表達對MPO酶活性有影響，其中MPO基因(-463G>A, rs2333227)的相關性較為顯著[3]。因其具有地區特異性，熊志等[4]和趙宗秀等[5]進一步對大陸人群的MPO基因(-463G>A, rs2333227)展開研究，發現MPO基因的表達與KD易感性及KD并發CAL可能存在較為顯著的相關性。通過以上研究分析，進一步驗證了基因與KD易感性的顯著相關性，而MPO基因(-463G>A, rs2333227)的發現，為KD并發CAL的病因方面提供了遺傳分子學數據。近幾年我國大陸內地對MPO基因與KD易感性及KD并發CAL的報道較為罕見，而探討蒙古族KD兒童基因方面的病因與該基因更是缺乏。本項研究通過提取研究對象血標本中的MPO基因rs2333227位點，探討在內蒙古地區的蒙古族KD兒童的該基因位點與KD易感性、KD并發CAL以及KD的典型臨床特點的關聯性，并為KD的病因學方面提供最新研究數據。

資料與方法

1.研究對象:選取2016年1月～2020年6月在內蒙古自治區兒童醫院確診的KD 100例蒙古族患兒為病例組。在相同時期選擇100例在內蒙古自治區兒童醫院兒保科健康體檢的蒙古族兒童為對照組(均排除心、肺、肝、腎及血液系統疾病)。病例組通過心臟超聲提示有無累及冠狀動脈，將KD患兒歸為CAL組，NCAL組。納入標準：(1)KD患兒：①年齡6月～5歲蒙古族兒童；②符合美國心臟協會發表2017年修訂的川崎病科學聲明的典型KD患兒[6]；③排除猩紅熱、葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合征、藥物過敏等疾病。(2)對照組：①年齡 6個月～7歲蒙古族兒童；②經體檢未發現異常的兒童，排除了各系統的疾病。本研究取得內蒙古自治區兒童醫院醫學倫理學委員會準許，并得到所有入組對象監護人的知情同意。所有入選對象均為祖籍三代居住在內蒙古地區、無血緣關系、無異族通婚史的蒙古族兒童。

2.方法：(1)收集KD患兒病初的臨床資料，包括年齡、性別、典型KD癥狀，以及血常規、血小板、紅細胞沉降率、N端腦鈉肽結果。(2)對兩組血液標本分別標記(病例組 A1-A50，對照組 D1-D50)，記錄相關資料，使用華大基因公司試劑提取盒提取基因，并完成直接基因測序：上游引物為：5′-TTCAAGCGATTCTTCTGC-3′，下游引物為：5′-AGGGTCCTCCTTCCTGTG-3′。PCR總反應體系50μl，含有10倍PCR反應緩沖液5μl，dNTP混合液4μl，引物各1μl，Ex公司 Taq酶0.25μl；測序反應體系為：2μl Mix(Bigdye3.1、5×sequencing buffer、H2O)，2μl純化后的PCR 產物，1μl引物(5mmol/L)。

結 果

1.一般情況:100例病例組中，男性60例，女性40例，患者平均年齡1.80±1.26歲；對照組100例兒童中，男性54例，女性46例，平均年齡1.78±1.33歲，兩組組間年齡和性別比例分布比較，差異無統計學意義(P均>0.05)；KD中有CAL組48例，男性28例，女性20例，平均年齡1.80±1.23歲；NCAL組中男性32例，女性20例，平均年齡為1.79±1.32歲。病例組、對照組兩組在年齡、性別間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，CAL組、NCAL組兩組在年齡、性別間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.PCR擴增產物的鑒定：MPO基因 rs2333227位點擴增產物的目標片段長度是665bp。以 Marker為參照標準，ddH2O為空白對照，圖1PCR產物于600～700bp間的條帶熒光度最適，且周圍無其余非目的性條帶存在，故提示該基因PCR擴增的產物濃度及純度已達到目標。

圖1 病例組與對照組MPO基因rs2333227位點基因型

3.MPO基因SNP位點基因型的確定及頻率分布:病例組和對照組MPO基因rs2333227位點GG、GA和AA基因型頻率分布比較，差異無統計學意義(χ2=2.392，P=0.302)，等位基因頻率分布比較，差異無統計學意義(χ2=1.592，P=0.351)，詳見表1。與GG基因型比較，GA和AA基因型與KD的發病風險無關(OR=0.64, 95%CI: 0.25～1.63，P=0.351)詳見表2。

表1 病例組和對照組MPO基因的等位基因頻率[n(%)]

表2 病例組和對照組MPO基因的相關性分析[n(%)]

4.CAL組和NCAL組MPO基因 rs2333227位點基因型及等位基因頻率分布：KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點GG、GA和AA基因型頻率分布比較，差異有統計學意義(χ2=6.263，P=0.044)，等位基因頻率分布比較，差異有統計學意義(χ2=4.037，P=0.045)，詳見表3。與GA和AA基因型比較，GG基因型增加CAL的發生風險(OR=5.13, 95%CI:1.22～21.63，P=0.026)，詳見表4。

表3 冠脈損害(CAL)組和非冠脈損害(NCAL)組的MPO基因等位基因頻率[n(%)]

表4 KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點的相關性分析[n(%)]

5.KD中基因多態性與臨床特征的相關性:MPO基因rs2333227多態性與KD臨床特征的相關性分析結果表明，皮疹、唇及口腔表現、手足癥狀、球結膜充血、淋巴結腫大、WBC、中性粒細胞百分比、紅細胞沉降率、CRP及BNP在基因型GG和GA+AA組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表5。

表5 MPO基因多態性與KD臨床特征的相關性分析

討 論

KD以6個月～5歲患兒為多發年齡段，是一種急性全身性中小血管炎性疾病，約30% KD患兒在病程中尤其是急性期時可發現冠狀動脈擴張，而冠狀動脈瘤的形成及破裂是KD患兒死亡的最重要原因[7,8]。目前國內外研究表明，KD并發CAL的高危因素主要包括患兒年齡及性別、合并感染程度、較長時間持續的發熱、實驗室相關指標以及遺傳基因等，故遺傳因素的影響不容忽視[9,10]。MPO是過氧化物酶亞家族的成員，一種可以調控自身免疫及炎性反應的血紅蛋白，對早期預警心血管疾病起著密切作用，是血管性炎癥的重要生物學標志物之一，存在于胞質與膜相結合的天青顆粒中，由單核細胞、中性粒細胞等炎性和免疫細胞分泌，當機體受到刺激時，激活的炎性、免疫細胞迅速釋放MPO，而MPO中的顆粒以脫顆粒形式或胞吐作用分泌到細胞外間隙中，催化過氧化氫與氯離子生成次氯酸，產生一系列的具有廣泛生物學效應的活性氧，并導致氧化過激，導致免疫功能紊亂，損傷內皮細胞，其中冠狀動脈的損傷較為多見[11]。因此MPO的任何異常表達和釋放都可能加重炎癥和組織的損傷[12～14]。有研究發現KD患兒的機體內存在過量氧化物，并可導致機體氧化應激，進而推測MPO基因與KD的發生可能存在關聯性[15]。因此，MPO基因可能是KD發病過程中潛在的關鍵因素。

在MPO與KD的相關性方面，本研究對象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，且達到了遺傳平衡，具有群體代表性，并在血液中均檢測到MPO基因rs2333227 位點，存在GG、GA、AA型3種基因型，這與我國報道文獻相同。經統計學分析得出，該基因的等位基因頻率在病例組與對照組的分布中差異無統計學意義(χ2=1.592，P=0.351)，3種基因型的頻率分布差異無統計學意義(χ2=2.392，P=0.302)，提示該基因位點與KD易感性無顯著相關性，這與文獻報道的結果有差異，考慮與種族、地域及遺傳易感性相關，今后需進一步加大樣本量開展深入研究[3～5]。

在MPO與KD臨床特點方面，目前大多數醫院對KD的診斷多以典型癥狀、實驗室檢測結果超聲心動圖結果為主要診斷方法。而在本研究中發現，KD典型臨床表現(如皮疹、唇及口腔表現、手足癥狀、球結膜充血、淋巴結腫大)與MPO 基因 rs2333227 位點的各基因型無明顯相關性，差異無統計學意義(P<0.05)，而熊志等[4]在該基因位點的研究中發現攜帶有GG基因型的患兒發生手足水腫、腹腔積液的比例較其他基因型患兒高，與本研究結果不同，考慮與樣本量少及地區差異有關。

在實驗室檢查方面與KD關系密切且研究較多的是WBC、中性粒細胞百分比、紅細胞沉降率、CRP及BNP，本研究中該基因位點與以上實驗室檢查結果無明顯相關性，差異無統計學意義(P<0.05)；這與彭宇等[16]、張娟等[17]研究結果相同，且對于大部分KD患兒的WBC、血小板計數、CRP、BNP和紅細胞沉降率是升高為主要表現。

在本研究中，MPO與KD并發CAL的研究結果是通過統計學分析得出MPO 基因 rs2333227 位點在CAL組和NCAL組中的3種基因型頻率分布比較差異有統計學意義(χ2=6.263，P=0.044)，故認為該基因位點與KD并發CAL可能有相關性；在兩組該基因位點的等位基因頻率分布的研究方面，其分布比較差異有統計學意義(χ2=4.037，P=0.045)，還發現GG基因型增加KD并發CAL的發生風險(OR=5.13, 95%CI:1.22～21.63)，進而推測該基因位點G等位基因可能增加KD并發CAL的風險；這與以往研究結果相同，該研究中與G等位基因比較，攜帶A等位基因的患者對KD的保護作用增加了1.37倍(OR=0.73，95%CI:0.54～0.98，P=0.033)。本研究該基因位點中A等位基因頻率在病例組、對照組中及CAL組及NCAL組中的分布比較差異無統計學意義，且國外報道推測MPO-463G>A(rs2333227)的A等位基因頻率在不同種族存在一定不同，如在歐洲人群中為22.8%，在亞洲人群中約為14.7%，結合本研究對象均為內蒙古地區蒙古族兒童，且樣本量不足，故對此結果仍須進一步完善及研究[18～20]。

目前已有多種基因被研究者發現與KD的易感性及并發CAL呈相關性，但關于單一致病基因對疾病發生影響的相關研究較少，結合此次研究樣本例數少，實驗條件較為局限性，各種與氧化應激有關的生物學標志物和中性粒細胞活化也未得到評估，且KD本身存在地區差異，MPO基因SNP rs2333227位點與KD的發生及KD并發CALs的確切關系尚需開展大樣本量、多中心的研究予以證實。