生物信息學分析胰腺癌組織關鍵基因表達及其意義

王乾合 趙立然 朱克祥

胰腺癌(pancreatic carcinoma)是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，在惡性腫瘤中是導致癌癥相關死亡的第3大原因。此外，胰腺癌的發生率正在逐年上升，據統計2019年在美國因胰腺癌而死亡人數為45750例[1]。歐盟癌癥數據庫統計結果顯示，胰腺癌在所有惡性腫瘤的發生率中排名第7位，病死率排名第4位，發生率與病死率大致相同，5年生存率不足8%[2]。胰腺癌早期患者通常無明顯癥狀，這一特征對胰腺癌的早期診斷造成了一定程度的困難。據統計只有約10%的胰腺癌患者能夠接受手術治療，但是術后易復發和轉移，患者5年生存率僅為25%。近年來胰腺癌的治療方案有了很大的改進，但由于患者的個體差異，其預后的敏感度和特異性仍不盡如人意。糖類抗原19-9(CA19-9)是胰腺腺癌臨床診斷和監測治療中最常用和最有效的血清腫瘤標志物。其診斷胰腺癌的特異性和敏感度分別為46%～98%和69%～93%[3]。因此，研究胰腺癌的病理機制，尋找早期檢測標志物，提高胰腺癌患者的生存時間和預后迫在眉睫。

生物信息學作為一門新的學科，它是把基因組DNA序列信息分析作為源頭，在獲得蛋白質編碼區的信息后進行蛋白質空間結構模擬和預測，然后依據特定蛋白質的功能進行必要的藥物設計。本研究結合人類腫瘤相關的基因表達匯編(gene expression omnibus，GEO)數據庫，篩選差異基因并進行深入分析，為胰腺癌的發生、發展提供理論依據。

材料與方法

1.數據來源：從GEO數據庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)獲取胰腺癌的表達譜芯片(GSE62452)，該數據集為全基因組mRNA表達芯片，其包含69例癌組織樣本，61例癌旁組織樣本。

2.數據處理：使用GEOquery包從GEO數據庫獲取胰腺癌相關芯片數據(GSE62452)，利用Limma包進行差異分析，差異基因閾值設為| log(fold change)|>1且P<0.01。

3.差異基因的富集分析：使用R語言的clustreProfiler包對上調基因和下調基因進行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)、GO(gene ontology)富集分析，以P<0.05作為納入標準。

4.蛋白互作網絡分析：將差異基因導入STRING(https：∥stringdb.org/)在線分析網站構建蛋白互作網絡(protein-protein interaction，PPI)，以combined score≥0.4為納入標準。將所得結果導入Cytoscape軟件進行可視化分析，并進一步篩選關鍵基因。

5.關鍵基因生存分析：使用GEPIA(http：∥gepia.cancer-pku.cn/)數據庫對胰腺癌的關鍵基因在胰腺癌和正常組織中的表達進行再次驗證，繪制Kaplan-Meier生存曲線探索關鍵基因表達高低與預后的關系。

結 果

1.差異基因篩選結果：通過對基因芯片GSE62452分析，以| log(fold change)|>1且P<0.01為標準共得到286個顯著差異基因，包含上調基因189個，下調基因97個。使用Volcano Plot包繪制火山圖(圖1)。

圖1 差異基因火山圖

2.差異基因富集分析：對上調和下調基因分別進行GO、KEGG分析, GO分析表明上調基因生物進程涉及細胞組織黏附、細胞外基質組織構成等功能，下調基因與脂類消化、細胞壁破裂等功能密切相關(表1)。

表1 胰腺癌組織差異基因GO富集分析結果

KEGG通路富集分析結果顯示，上調基因主要涉及蛋白消化與吸收、PI3K-Akt等信號通路(圖3)，下調基因主要與胰腺分泌等信號通路密切相關(圖4、表2)。ECM-受體相互作用和胰腺分泌分別是上調基因和下調基因富集的主要通路(圖5、圖6)。

圖5 上調基因KEGG分析結果

圖6 下調基因KEGG分析結果

表2 胰腺癌組織差異基因KEGG富集分析結果

圖3 上調基因GO分析結果

圖4 下調基因GO分析結果

3.構建PPI網絡：將差異基因導入STRING在線網站進行蛋白互作網絡分析，所得結果導入Cytoscape軟件篩選關鍵基因，最終得到20個關鍵基因(ITGB4、PLA2G1B、CTRC、CPB1、SYCN、ITGA2、ALB、CELA3B、PLAU、MMP11、LAMB3、PNLIP、CLPS、CPA1、ITGB6、PRSS3P2、LAMC2、LAMC3、MMP7、CPA2)。這些核心基因相互關聯，可能在胰腺癌的發生、發展中發揮協同作用(圖7)。富集分析結果表明，20個核心基因主要涉及ECM-受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt信號通路等。

圖7 20個關鍵基因蛋白互作網絡

4.生存分析及核心基因驗證：利用GPEPIA數據庫對20個關鍵基因進行驗證。生存分析顯示，MMP11、LAMB3以及PLAU與胰腺癌預后密切相關(圖8)，在芯片數據GSE28735分析45例胰腺癌組織和配對的癌旁正常組織對核心基因進行驗證，在兩個GEO數據集中，PLAU、MMP11及LAMB3在胰腺腫瘤組織中顯著上調(表3)。

表3 胰腺癌中PLAU、MMP11及LAMB3在兩個數據集的差異表達

圖8 生存曲線

討 論

在美國，胰腺癌是癌癥相關死亡的第4大原因，且發生率還在不斷上升,預計到2030年將成為第2大常見惡性腫瘤[4]。胰腺癌的危險因素包含吸煙、家族史、慢性胰腺炎、年齡增長、男性、糖尿病、肥胖、非O血型、葉酸飲食以及幽門螺桿菌感染和牙周疾病[5]。近年來胰腺癌的診斷取得了一定程度的進步，超聲內鏡造影(CE-EUS)、EUS彈性成像或EUS引導下細針穿刺活檢腫塊均有助于檢測發現早期胰腺癌，尤其是對于影像學無法識別的無癥狀胰腺腫塊[6]。到目前為止，還沒有針對胰腺癌的特異性生物學標志物。對于這種致命疾病的早期診斷，仍然需要新的、更敏感的生物學標志物。

本研究采用生物信息學方法對胰腺癌GSE62452芯片進行分析，共獲得286個差異基因，其中包含上調基因189個，下調基因97個。GO和KEGG富集分析結果顯示上調基因涉及細胞組織黏附、細胞外基質組織構成等功能以及蛋白消化與吸收、PI3K-Akt等信號通路相關。下調基因與脂類消化、細胞壁破裂等功能和胰腺分泌等信號通路密切相關。通過蛋白互作網絡篩選出20個關鍵基因，利用GEPIA數據庫對關鍵基因進行生存分析驗證，顯示基因MMP11、LAMB3及PLAU可能與胰腺癌的發生、發展密切相關。

纖溶酶原激活物尿激酶(PLAU)是一種絲氨酸蛋白酶，主要表達于內質網腔，在炎癥與癌癥進程中均發揮著重要作用，例如，能夠調節細胞遷移、增殖、黏附，同樣也參與肝臟、肌肉以及軸突再生。PLAU結合其受體PLAUR啟動蛋白水解級聯反應，將纖溶酶原轉化為纖溶酶。PLAU參與多種癌癥中的發展，例如胃癌、結腸癌、胰腺癌。PLAU的活性也是乳腺癌和非小細胞肺癌預后和預測因素的生物學標志物[7]。研究結果顯示，胰腺癌中PLAU表達明顯上調[8]。本研究發現PLAU在胰腺癌中明顯上調，與上述文獻結果一致，但有關PLAU在胰腺癌中的實驗驗證尚未見報道，需要開展進一步研究予以驗證。

基質金屬蛋白酶-11(matrix metalloproteinase, MMP11)是MMP家族的一種蛋白水解酶，基質蛋白(MMPs)是一種鋅依賴性的內肽酶家族，主要參與細胞外基質降解和組織重塑。目前為止已經發現了24種哺乳動物基質金屬蛋白酶，這些酶參與胚胎發育、血管生成、傷口愈合、細胞凋亡、排卵、神經生長等生理過程。其活性受天然組織特異性抑制劑蛋白(TIMPS)的控制, MMPs與TIMPS的失衡與癌癥的進展和轉移密切相關，MMPs同樣在骨關節炎、類風濕關節炎、牙周病、肺氣腫、皮膚潰瘍、動脈粥樣硬化、主動脈瘤以及中樞神經系統疾病中扮演著不可或缺的角色。研究證實癌癥相關成纖維細胞中的外泌體miRNA-139通過抑制MMP11表達抑制胃癌的進展[9]。Eiro等[10]研究246例女性浸潤性乳腺癌患者顯示，癌癥相關成纖維細胞表達的MMP11是預測乳腺癌總生存期和無復發生存期最有效的獨立因素。Lee等[11]通過生物信息學分析得出MMP11可作為胰腺癌患者預后標志物。

層粘連蛋白亞基β3(LAMB3)是編碼組成 LM-332的三聚體蛋白之一，由角質細胞分泌的細胞外基質蛋白，是基底層重要的生物活性成分，影響著細胞分化、遷移和黏附以及細胞增殖和存活[12]。LM-332的α3、β3和γ2鏈分別由3個不同的基因LAMA3、LAMB3和LAMC2編碼。LAMB3對于結腸、胰腺、肺、宮頸和前列腺中腫瘤細胞的侵襲性和轉移能力是不可或缺的[13]。在甲狀腺乳頭狀癌中，LAMB3通過調節c-MET/Akt信號介導轉移瘤行為[12]。Kita等[14]研究表明LAMB3能夠作為食管鱗狀細胞癌診斷和預后的標志物。有研究表明，LAMB3可作為頭頸部鱗狀細胞癌的預后生物學標志物，LAMB3沉默可增強順鉑等抗癌藥物的敏感度[15]。在胰腺癌中，Zhang等[16]通過實驗證明LAMB3可以通過調節PI3K-Akt信號通路來介導胰腺導管細胞癌腺癌的細胞周期停滯和凋亡，并改變PDAC的增殖、侵襲和轉移行為。Huang等[17]通過使用皮下異種移植腫瘤模型證明miR-24-3p/LAMB3軸在胰腺導管腺癌的進程中起著至關重要的作用，并表明miR-24-3p/LAMB3軸可能代表了胰腺導管腺癌新型治療靶點。此外有研究證明，LAMB3可作為胰腺導管腺癌的預后生物學標志物[18]。

對差異基因進行功能與通路富集分析結果表明，細胞外基質受體相互作用、黏著斑、胰腺分泌、蛋白消化與吸收等信號通路與胰腺癌的發生、發展機制有著密切的聯系。黏著斑激酶(FAK)是一種胞質蛋白酪氨酸激酶，在多種實體癌中過表達和激活。FAK通過影響腫瘤微環境中的癌細胞以及基質細胞來促進腫瘤進展和轉移[19]。據文獻報道，雌激素G蛋白偶聯雌激素受體(GPER)信號通路可能是參與FAK乳腺癌進展的轉導機制之一[20]。黏著斑激酶表達強度與胃癌患者的遠端轉移程度相關。文獻結果顯示，MMP11通過黏著斑激酶/Src激酶(FAK/Src)途徑增加了口腔鱗狀細胞癌細胞的運動能力[21]。抑制LAMB3能夠激活FAK信號通路，驅動腫瘤的生長[22]。然后，PLAU與FAK間的關系尚未見報道，仍需開展深入研究。