線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白酶PRDX3在主動脈夾層中的表達及其意義

鄭思豪 王志維

主動脈夾層(aortic dissection,AD)是一種極其兇險的大血管疾病，起病急驟，病死率高[1]。典型的AD表現(xiàn)為主動脈內(nèi)膜撕裂，血液由破口涌入中膜內(nèi)，主動脈中膜沿長軸分離，形成假腔。AD主要病理改變?yōu)橹鲃用}中層退行性變(aortic media degeneration，AMD)，AMD的特征是主動脈中層血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的損失、細(xì)胞外基質(zhì)紊亂、彈性纖維斷裂以及蛋白聚糖和葡糖胺聚糖的聚集。其組織學(xué)特征包括慢性外膜和中膜炎性細(xì)胞浸潤、彈性蛋白斷裂和變性以及由跨壁血管炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)降解和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)構(gòu)成的中膜衰減[2]。

現(xiàn)有研究顯示，線粒體氧化應(yīng)激對調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激等具有極其重要的作用,其在腫瘤、心力衰竭、擴張型心肌病、心肌梗死后的缺血再灌注損傷等中均發(fā)揮重要作用[3]。但是線粒體氧化應(yīng)激與AD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其在主動脈平滑肌(VSMCs)凋亡中的作用聯(lián)系尚未有具體的研究。本研究通過分析線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白-過氧化還原酶3(PRDX3)在AD患者和AD大鼠模型主動脈組織中的表達差異情況，研究其在主動脈夾層發(fā)生過程中的作用，旨在為主動脈夾層診療提供新靶點。

材料與方法

1.標(biāo)本與實驗分組:選取2018年8月～2019年4月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院確診為StanfordⅠ型夾層并行胸主動脈全弓置換患者14例為AD組(n=14)，患者均經(jīng)過CTA檢查確診為胸主動脈夾層，三維重建的結(jié)果顯示破口位于升主動脈。所有患者術(shù)前均無冠心病、外周血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、膜性腎病?；颊呔谌朐汉笮屑痹\手術(shù)，術(shù)中取AD患者病變組織。組織取出后用預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液漂洗，一部分凍存于液氮中，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于進行后續(xù)檢測。另選取5例心臟移植患者作為對照組(此5例患者均無大血管疾病，其在心臟移植術(shù)中取下的心臟主動脈血管可作為相對正常主動脈血管組織)。術(shù)前所有實驗方案均已告知家屬，并簽署知情同意書，且該部分實驗經(jīng)武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批同意[倫理審批編號：WDRM動(福)第20201107號]。

2.實驗動物與模型構(gòu)建：選用SPF級野生型4周齡SD大鼠18只，實驗動物均由武漢大學(xué)動物實驗中心提供[動物使用許可證號：SYXK(鄂)2015-0027]，飼喂于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗中心。將實驗動物采用數(shù)字表法隨機分為AD組(n=9)及對照組(n=9)。AD組飼喂含0.3%β-異氨基丙腈酯(BAPN)的維持飼料進行主動脈夾層動物模型構(gòu)建，對照組飼喂普通飼料。動物模型構(gòu)建后密切觀察造模大鼠生存狀況，若大鼠在造模過程中死亡，立即解剖明確死因，并收集主動脈撕裂范圍的主動脈組織標(biāo)本。4周后各組存活大鼠統(tǒng)一取材(AD組取主動脈撕裂部位，對照組取相應(yīng)部位血管)，主動脈標(biāo)本液氮凍存或4%多聚甲醛固定用于后續(xù)實驗。

3.氧化應(yīng)激細(xì)胞模型構(gòu)建：培養(yǎng)人主動脈血管平滑肌細(xì)胞(HASMC)至80%后，實驗組加入不同濃度的H2O2，對照組不做處理。

4.實驗試劑：PRDX3抗體購自中國北京Bioss生物技術(shù)公司；β-氨基丙腈酯(BAPN)購自日本TCI公司(貨號A0796)；β-actin抗體購自中國武漢Servicebio生物技術(shù)公司；抗兔二抗購自美國Cell Signaling Technology公司(貨號：5151P)。

5.Western blot法實驗：按照分組要求處理組織后，取約100mg組織于1.5ml EP管內(nèi)，加入含有適量比例的Cocktail及PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，液氮研磨儀研磨組織。所得樣品于冷凍離心機中以4℃ 12000r/min離心20min，取上清，所收集上清液置于冰上超聲碎裂。根據(jù)所獲得蛋白上清液的體積，以適當(dāng)?shù)谋壤尤?×蛋白上樣緩沖液混勻，100℃金屬浴15min，所獲蛋白樣本凍存于-80℃冰箱中。每孔蛋白上樣量為10μg，電泳電壓90V，電流40mA，以12%SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠進行Western blot法電泳。在電流200mA，電壓100V條件下電轉(zhuǎn)2h。其后TBST洗膜，5%脫脂奶粉封閉1.5～2.0h，一抗(anti-PRDX3)4℃搖床孵育過夜，β-actin為內(nèi)參，以山羊抗兔熒光二抗顯影，在Odessy熒光掃膜系統(tǒng)上掃膜，并對結(jié)果進行半定量分析。

6.免疫組織化學(xué)實驗：各組標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后進行切片。選取適量切片后將切片置于65℃恒溫烘箱中加熱融蠟2h，然后放入二甲苯溶液中脫去殘留的石蠟，進行常規(guī)的水化步驟后用PBS漂洗。用triton試劑破膜15min，而后在枸櫞酸緩沖溶液中進行微波加熱修復(fù)。自然冷卻后，用3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，血清常溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜。室溫復(fù)溫1h，二抗避光孵育1h。用DAB染色液在顯微鏡下顯色，顯色后蘇木精染核，鹽酸乙醇分化，漂洗干凈后進行風(fēng)干，中性樹脂封片，最后在全自動顯微鏡下觀察拍照。

7.統(tǒng)計學(xué)方法：以Graghpad軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，至少取3次獨立實驗結(jié)果。計量資料的兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組人體主動脈組織中PRDX3表達比較:Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，AD組患者主動脈血管PRDX3的表達在mRNA水平及蛋白水平均較對照組主動脈明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，圖1)；人體組織免疫組化結(jié)果顯示，AD患者主動脈組織中PRDX3表達較對照組明顯增高，表現(xiàn)為顯微鏡下主動脈血管中膜中出現(xiàn)大量高表達的陽性型號(圖2)，用Image J軟件進行陽性率統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，AD組與對照組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 Western blot法檢測人體組織PRDX3表達

圖2 人體主動脈組織標(biāo)本間免疫組織化學(xué)染色

2.兩組大鼠主動脈組織中PRDX3的表達:免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD組較對照組PRDX3表達明顯增高，表現(xiàn)為顯微鏡下主動脈組織胞質(zhì)中出現(xiàn)大量高表達的陽性型號(圖3)。

圖3 大鼠主動脈組織免疫組織化學(xué)染色

3.不同組H2O2濃度下HVSMCs表達PRDX3的比較：HVSMCs培養(yǎng)至80%加入過氧化氫處理后，Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，H2O2實驗組PRDX3的表達隨著H2O2濃度的升高而增高(圖4)，并在蛋白水平較對照組明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 Western blot法檢測細(xì)胞模型內(nèi)PRDX3表達

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，AD患者主動脈組織中過氧化物還原酶3的表達在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均較正常對照主動脈組織明顯增加，提示在主動脈夾層發(fā)病過程中線粒體氧化應(yīng)激水平明顯升高。同時在免疫組化染色中發(fā)現(xiàn)，在胞質(zhì)中出現(xiàn)的大量陽性信號也提示在線粒體中可能發(fā)生了氧化應(yīng)激水平的升高，表現(xiàn)為AD組中PRDX3的表達較正常對照組的明顯增高。但是由于人體組織標(biāo)本之間存在的年齡、性別、家族遺傳、生活條件差異性可能帶來不可避免的誤差，會導(dǎo)致樣本均一性相對較差。為此本研究構(gòu)建了大鼠主動脈夾層動物模型，進一步證實線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白PRDX3的表達升高可能與主動脈夾層具有密切的聯(lián)系。

主動脈夾層作為一類致死率極高的主動脈疾病，其病理變化表現(xiàn)包括主動脈血管平滑肌細(xì)胞的丟失和凋亡過多，彈力纖維斷裂，細(xì)胞外基質(zhì)膠原沉積過多[4]。既往研究更多地涉及血管組織的中膜結(jié)構(gòu)，而對于線粒體這一細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器涉及較少。線粒體作為體內(nèi)主要的供能細(xì)胞器，其功能失調(diào)會導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境系統(tǒng)的紊亂[5, 6]。同時線粒體是大量的氧化還原反應(yīng)的場所所在，主動脈夾層的發(fā)生、發(fā)展涉及多個器官系統(tǒng)的功能失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)超氧離子的聚集導(dǎo)致線粒體膜電位下降線粒體結(jié)構(gòu)損傷從而功能受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生主動脈夾層。線粒體對氧化還原應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)可能涉及線粒體通道，如線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)和內(nèi)膜陰離子通道(IMAC)。它們的激活導(dǎo)致線粒體內(nèi)和線粒體間氧化還原環(huán)境的改變，從而導(dǎo)致ROS的釋放[7]。AD的發(fā)展進程中長期全身炎性介質(zhì)的釋放可能參與其中，帶來的是過量的ROS產(chǎn)生和聚集，而ROS的上升超過“正常”或“生理”的閾值水平，會導(dǎo)致一種通常被稱為“氧化應(yīng)激”的過程[8,9]。在正常生理條件下，線粒體負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)大部分H2O2的產(chǎn)生，ROS也能作為細(xì)胞內(nèi)信號分子發(fā)揮作用，既往研究已經(jīng)證明，H2O2可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的表型改變，促進細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致鈣化等血管病變[10，11]。

過氧化還原蛋白(peroxiredoxin，PRDX)是一個高度保守的過氧化物酶家族，其維持細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的動態(tài)平衡[12]。該家族成員在大多數(shù)生物體中都有表達并參與各種生物學(xué)過程，在活性氧(ROS)產(chǎn)生、炎癥、腫瘤、動脈粥樣硬化、心力衰竭等中均發(fā)揮相應(yīng)作用[13～16]。哺乳動物線粒體產(chǎn)生過量活性氧(ROS)所致的線粒體損傷是許多疾病中氧化損傷的基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激下線粒體產(chǎn)生的過量活性氧(ROS)可導(dǎo)致線粒體蛋白質(zhì)、線粒體膜和DNA的氧化損傷，損害線粒體合成ATP及其廣泛代謝功能的能力，包括對大多數(shù)細(xì)胞正常運轉(zhuǎn)至關(guān)重要的三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、尿素循環(huán)、氨基酸代謝、血紅蛋白合成和FeS中心組裝[17]。線粒體氧化損傷時還可以通過增加細(xì)胞色素C(cyt C)等膜間隙蛋白從而激活細(xì)胞凋亡[18]。PRDX3作為一種內(nèi)源性過氧化物清除劑，在正常生理情況下，PRDXs的產(chǎn)生與ROS處于動態(tài)平衡的狀態(tài)[19]。當(dāng)發(fā)生主動脈夾層等疾病導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)，線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的ROS，隨之而來的是線粒體內(nèi)的過氧化物清除劑-過氧化還原蛋白PRDX3的升高，用以清除過量的ROS。主動脈夾層發(fā)生時產(chǎn)生的大量ROS時伴隨而來的是機體隨之而來的PRDXs的上調(diào)，當(dāng)上調(diào)的PRDXs不足以清除過量的ROS時，過量的ROS會導(dǎo)致線粒體破碎，平滑肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致主動脈夾層的發(fā)生。

綜上所述，在主動脈夾層的發(fā)生、發(fā)展過程中，ROS的爆發(fā)可以導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激的發(fā)生，使線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)過氧化還原蛋白PRDX3上調(diào)；如果過氧化清除劑-PRDX3的產(chǎn)生不足以清除過量的ROS，線粒體穩(wěn)態(tài)無法恢復(fù)，過量的ROS則會使得線粒體功能受損、破裂，同時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終促進主動脈夾層的發(fā)生、發(fā)展。對主動脈夾層發(fā)病機制的進一步探究能夠揭示主動脈夾層這一危險疾病的發(fā)病機制，從而為未來主動脈夾層的早期治療提供新的治療思路及靶點。