PDGF-BB 基因多態性與新疆地區不同民族人群骨關節炎易感相關性研究

王夢雨，王 超，朱洲均，石 沖，向 偉，王 堆，邱貞宇，史晨輝，王維山*

1.石河子大學第一附屬醫院 骨科中心，新疆 石河子 832000；2.石河子大學 醫學院，新疆 石河子832000

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種受生物力學與生物化學共同影響的慢性退行性關節疾病，是成年人常見的肌肉骨骼疾病。據估計，到2040 年將有7 800萬人患骨關節炎[1]，導致殘疾和生活質量下降。關節疼痛是骨性關節炎的明確癥狀，但其病因尚不清楚[2]。OA 的發生與遺傳、年齡、性別、體重、關節創傷和異常機械負荷等因素有關[3]。OA 病變主要包括關節軟骨退變鈣化、滑膜炎癥、骨贅形成、軟骨下囊腫、軟骨下骨重塑、硬化、血管侵襲以及骨軟骨界面滲透性增加[4-5]。OA 與民族、性別、體重、年齡、遺傳、飲食、生活方式及生活環境等密切相關，不同國家、地區、民族其患病率及影響因素均不相同。軟骨下骨血管生成增多，血管突破基底進入無血管軟骨，是骨關節炎的診斷特征。Xu 等[6]研究證明來源于破骨細胞的PDGF-BB 是骨關節炎發展過程中病理軟骨下骨血管生成的關鍵驅動因素。

本研究分析新疆地區人群原發性膝骨關節炎(primary knee osteoarthritis，PKOA)的PDGF-BB 基因型，旨在探討新疆地區漢族、維吾爾族人群基因型頻率分布，為其與原發性OA 等相關的研究提供依據，從基因角度探討原發性OA 發病的遺傳易感因素。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機選取2019 年1 月至2020 年11 月石河子大學第一附屬醫院、農三師醫院、圖木舒克市人民醫院PKOA 漢族患者80 例，其中男性28 例，女性52例(年齡48～81 a，平均年齡56.66 a)，正常對照組186 例(年齡41～74 a，平均年齡55.61 a)，男性78例，女性108 例；維吾爾族PKOA 患者91 例，其中男性42 例，女性49 例(年齡41～72 a，平均年齡56.82 a)，正常對照組162 例，男性63 例，女性99例(年齡40～78 a，平均年齡54.30 a)。所選取的研究對象均為長期生活在新疆地區的人群。

1.2 主要儀器與試劑

PCR 熱循環儀(Eppendorf Master-cycle gradient，Germany)，低溫高速離心機(HerauesD-37520，Germany)，F-90 型多功能暗箱紫外透射儀，DNA 試劑提取盒(北京天根生化公司)，瓊脂糖，rs1800817、rs2285094 Pcr 上下游引物。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

住院或在門診取病人的外周血2 ml，存放于EDTA 管中；農三師和圖木舒克的樣本根據病人信息在當地醫院檢驗科中收集。將所收集的樣本放置于-80 ℃冰箱中儲存。

1.3.2 DNA 的提取

采用全血DNA 基因提取盒，按照操作步驟提取DNA，將提取出的DNA 至于1.5 ml 凍存管中，并在紫外線分度儀下測出提取的DNA 濃度，將濃度合格的DNA 樣本至于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.3 引物設計

使用上海生工生物有限公司的軟件設計PDGFBB 的rs1800817 位點上游引物CGC TCT TCC TGT CTC TCT GC；下游引物GTT CTC GGG TTC CCA AAG GG。rs2285094 位點的上游引物CCA TGT GCT GAC CAC TTC AT；下游引物GCC ACA TAA CAG GTC TGG CT。

1.3.4 PCR 擴增

使用移液槍將解凍好的DNA 吸出3 μl、rs2285094 位點上及下游引物各1 μl、PCR mix10μl、無酶水5 μl 至離心管中組成共20 μl 的反應體系(見表1)；將PCR 管放入96 孔的梯度PCR 儀里之后再設定PCR 擴增反應條件：①預變性94 ℃5 min②變性94 ℃30 min ③退火62 ℃30 min ④延伸72 ℃27 min ⑤重復延伸72 ℃5 min ⑥取出反應體系標記并放入-20 ℃冰箱中備用。用相同的方法進行rs1800817 位點DNA 擴增。

表1 PCR 反應體系

1.3.5 凝膠電泳及成像

用微量加樣槍吸出6 μl DNA maker 加入凝膠的第一個孔中，再取4 μl DNA 與DNA 上樣緩沖液(loading buffer1 μl)的混合液加入其他凝膠孔內并做好記錄。將完成加樣的凝膠平放在水平電泳儀的電泳板上，向電泳板內加入TBE 溶液進行電泳。電泳參數：電壓100～120 V；電泳時間：35 min。在電泳結束后，將電泳凝膠取出放在成像儀內，通過調整凝膠塊位置合適后進行曝光，將曝光后的圖像保存并記錄。

1.3.6 DNA 測序

將經過凝膠電泳過并通過凝膠成像系統確認PCR 成功后的DNA 樣本標號記錄，送至博邁德(北京)基因技術有限責任公司進行DNA 雙向測序。

1.4 統計分析

本研究利用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。對樣本人群的年齡、身高、體重等計量資料進行正態性檢驗，符合正態分布的資料采用ˉx±s 進行統計描述，對分類資料如性別、是否吸煙、是否飲酒等采用n(%)表示；采用哈迪-溫伯格平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium)方法對基因位點的基因型分布進行檢驗；對兩組間計量資料的比較采用t 檢驗，對計數資料的比較采用卡方檢驗；應用 二分類logistic回歸模型對患PKOA 的相關風險因素進行分析。其中以P＜0.05 作為差異具有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 研究對象的基線資料比較

分別對新疆地區的漢族與維吾爾族膝骨性關節炎組與非膝骨性關節炎組的年齡、身高、體重、BMI、性別、是否抽煙、是否喝酒(見表2)進行比較，各組間無統計學差異(P＞0.05)。性別、是否吸煙、是否飲酒、是否從事重體力勞動進行比較，各組間無統計學差異(P＞0.05)。見表2。

表2 一般資料

2.2 PCR 和基因測序結果

將所提取的漢族PKOA 組和對照組、維吾爾族PKOA 組和對照組的DNA 分別加入PDGF-BB 的rs1800817 位點引物、rs2285094 位點的引物在PCR儀中擴增，將擴增后的DNA 行2%瓊脂糖凝膠電泳。將擴增結果滿意的DNA 送至北京博邁德基因公司進行雙向測序，分析受試者的 PDGF-BB 的rs1800817 位點、rs2285094 位點基因型。比較SNP中的rs1800817 位點與實驗中的rs1800817 位點，有GT、GG 兩種基因型；比較SNP 中的rs2285094 位點與實驗中的rs2285094 位點，有CT、CC 兩種基因型。

2.3 PDGF-BB 的rs1800817 位點、rs2285094 位點基因多態性與維吾爾族PKOA 的相關性

維吾爾族PKOA 組PDGF-BB 的rs2285094 位點的CC型、CT型分布不同(χ2=17.9，P＜0.001)，有統計學差異，PKOA 組PDGF-BB 的rs1800817 位點的GT 型、GG 型分布不同(χ2=5.08，P＜0.05)，無統計學差異。見表3。說明維吾爾族攜帶rs2285094和rs1800817 位點的CC 型、CT 型的個體患原發性PKOA 有相關性。

表3 維吾爾族PKOA 與對照組的基因型分布

2.4 PDGF-BB 的rs1800817 位點、rs2285094 位點基因多態性與漢族PKOA 的相關性

漢族PKOA 組PDGF-BB 的rs2285094 位點的CC型、CT 型分布(χ2=0.001，P=0.98)與非PKOA 組無統計學差異，PKOA 組PDGF-BB 的rs1800817 位點的GT型、GG 型分布(χ2=4.61，P=0.032)與非PKOA 組有統計學差異。見表4。說明漢族攜帶rs1800817 位點的CC 型、CT 型的個體患PKOA 有相關性；而與攜帶rs2285094 無相關性。

表4 漢族PKOA 與對照組的基因型分布

2.5 影響OA 患病率的多因素Logistic 回歸分析

經多因素Logistic 回歸分析，年齡、民族、rs1800817位點、rs2285094 位點基因多態性是OA 的危險因素；其中民族是PKOA 的危險因素，這可能與不同民族間的生活方式及飲食不同有關，性別、BMI、抽煙、飲酒、從事重體力勞動不是OA 的危險因素。見表5。

表5 影響OA 患病率的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

OA 是全球最常見的關節疾病，60 a 以上的男性約有10%，女性約有18%[5-6]。較大的體重、反復外傷或手術聯合結構、出生時關節異常、痛風、糖尿病以及與荷爾蒙相關的疾病等，已經被證明為OA[7-8]的風險增加，其特征是進行性退化的關節軟骨，軟骨下骨的結構改變，骨贅形成和滑膜炎癥[9-11]。此外，血管生成在組織修復和骨性關節炎的病理生理中起著重要作用[12]。但目前治療骨關節炎尚未有有效的疾病調節劑，Walsh 和Mapp 等研究表明骨關節炎關節內的血管生成，即從已有的血管中生成新血管，是已知的促進OA 進展的因素[13-14]。特別是軟骨下異常的骨血管生成導致血管系統入侵骨軟骨連接是人類骨關節炎的一個標志[15]。有研究表明PDGF-BB 的基因多樣性與金屬裸支架術后再狹窄有一定的關系[16]。Arora-Singh和Gourh 在研究中發現PDGF-BB 中的rs2285094位點基因多樣性與硬皮病的發生有一定的相關性。[17-18]近年來Su 等[19]在實驗研究中發現PDGFBB 異常增加，誘導軟骨下骨血管生成，促進骨關節炎的發展。

綜上所述，PDGF-BB 與骨關節炎的發生發展有著密切的關系。PDGF-BB 基因多樣性與許多疾病都有著密切關系，但PDGF-BB 基因多樣性與骨關節炎的關系以往無相關的研究。本實驗通過病例對照研究，使用卡方檢驗、多因素logistic 回歸等方法，分析了PDGFBB的rs1800817位點、rs2285094位點多樣性與新疆地區漢族和維吾爾族膝骨性關節炎發病風險的關聯。研究結果表示，rs1800817 位點基因型分布在漢族和維吾爾族中均有差異(χ2=5.08，P=0.024；χ2=4.61，P=0.032)；rs228509 位點基因型分布在漢族中無差異(χ2=0.01，P=0.98)；rs2285094 位點基因型分布在維吾爾族中有明顯差異(χ2=17.79，P=0.00)。通過多因素logistic 回歸分析，年齡是骨性關節炎的危險因素(OR=1.007)，民族是骨性關節炎的保護因素，這可能是維吾爾族與漢族的生活習慣不同所造成的，這與沈明球等人的流行病學研究所一致[20]。rs2285094 位點中的CC型和CT 型是骨性關節炎的保護因素(OR=0.011)，這提示rs2285094 位點中的CC 型和CT 型攜帶者可能會減低發病風險，但該位點的基因型分布在漢族人群中的分布無差異(χ2=0.01，P=0.98)；rs1800817 位點中的GT 型和GG 型是骨性關節炎的危險因素，這提示rs1800817 位點中的GT 型和GG 型攜帶者可能會增加發病風險。這可能與本研究樣本量較小有關，限制了相關性的統計功效，存在一定局限性。此外，PDGF-BB基因多態性對膝關節骨性關節炎易感性可能為原發性膝骨性關節炎的預防和治療提供依據，因此有關結論尚需進一步驗證。