狂犬病病毒(RABV)感染小鼠原代神經元細胞對Bif-1蛋白表達的影響

李武建,金宏麗,焦翠翠,時智康,張 穎,黃 培,伊淑帥,閆飛虎,趙永坤,高玉偉,楊松濤*,王化磊*,夏咸柱

(1.吉林大學 動物醫學學院,吉林 長春 130062；2.軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所 吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室,吉林 長春 130122；3.吉林農業大學 動物科學技術學院,吉林 長春 130118；4.東北林業大學 野生動物與自然保護地學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

Bif-1(Bax-interacting factor-1)又稱Endophilin-B1,是CUDDEBACK等[1]在2001年發現的一種新的Bax綁定蛋白。Bif-1是一種進化上保守的、位于胞漿的多功能蛋白質,參與細胞自噬[2-3]、細胞凋亡[4]以及線粒體動力學[5]等生理過程。越來越多的研究表明Bif-1參與調節骨平衡[6]、癌癥[7]、缺血性中風[8]、脂滴降解[9]及神經性疾病[10]等多種過程。

研究表明,Bif-1的氨基端含有1個N-BAR(bin-amphiphysin-rvs)結構域,具有膜綁定、彎曲活性；羧基端含有1個SH3(src homology 3)結構域,能與脯氨酸富集區結合。Bif-1各亞型具有相同的SH3結構域,由于mRNA的選擇性剪切,使Bif-1b/c的N-BAR結構域發生了改變[11]。Bif-1不同亞型在不同細胞內功能不盡相同。Bif-1a是非神經元細胞的主要剪切異構體,研究顯示其具有促進凋亡的作用；“神經特異性”的Bif-1c在多種疾病中對神經元細胞具有保護性作用。

在自然條件下,狂犬病病毒(rabies virus,RABV)主要侵襲動物或人的神經系統,尤其是中樞神經系統(CNS)。有研究表明,引起狂犬病的主要原因是神經元功能異常,而不是神經元死亡。雖然狂犬病臨床癥狀嚴重,但中樞神經元細胞缺乏明顯的病理學變化,限制了RABV致病機制相關研究。本試驗通過建立RABV CVS-11株感染原代神經元細胞模型,并利用該模型檢測RABV感染對Bif-1蛋白表達水平的影響,為進一步研究Bif-1蛋白在RABV致病中的作用及其分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、病毒及實驗動物質粒pcDNA3.1-N,RABV CVS-11株由軍事科學院軍事醫學研究院軍事獸醫研究所動物病毒學與特種動物疫病學實驗室保存。10周齡ICR小鼠、懷孕14～16 d ICR孕鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司。

1.2 主要試劑Neurobasal-A無血清培養基、B-27補充物、L-谷氨酰胺(L-Gln)、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；DNase Ⅰ、Poly-D-Lysine、Ara-C購自Sigma公司；RABV N蛋白抗體,小鼠抗Bif-1單克隆抗體購自美國Novus公司；FITC標記的RABV N蛋白單克隆抗體購自日本FUJIREBIO公司；兔抗MAP2單克隆抗體購自美國CST公司；小鼠抗β-actin抗體購自北京銳抗生物技術有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠二抗購自Sigma公司；Alexa Fluor 594羊抗兔lgG熒光二抗購自美國Thermo公司。

1.3 RABV感染小鼠原代神經元細胞

1.3.1小鼠原代神經元細胞的分離培養及形態學觀察 麻醉懷孕14～16 d ICR小鼠,取出胎鼠,置于預冷的DMEM液體培養基中，在光學解剖顯微鏡下剝取大腦皮質組織,仔細剝除軟腦膜及血管等，在60 mm×15 mm培養皿中,使用預冷的DMEM液體培養基洗滌組織3次,4 000 r/min離心5 min，沉淀洗滌3次；最后1次用0.25%胰酶重懸,補足0.25% EDTA胰蛋白酶至20 mL(含DNase Ⅰ 0.1 g/L),37℃條件下搖床消化30 min；向組織懸液加入少許胎牛血清終止消化后,依次經過70，40 μm孔徑細胞篩網過濾得到細胞懸液；2 000 r/min離心5 min后,棄上清，加入 Neurobasal-A完全培養基(2% B-27+1%L-Gln+1%抗生素)重懸細胞；細胞計數并稀釋,按每孔1×106個接種于預先經 0.1 g/L PDL包被液包被的6孔板中，37℃、5% CO2分離培養；24 h后全量換液,同時加入0.01 mmol/L Ara-C抑制膠質細胞貼壁或生長，每48 h半量換液1次，體外培養5～7 d，依據細胞生長狀態用于后續研究。

1.3.2RABV感染及鑒定 將培養5～7 d且生長狀態良好的原代神經元細胞棄去培養基,PBS洗2次；將RABV按MOI=0.1接種于原代神經元細胞,置于37℃、5% CO2培養箱中孵育1 h；棄去病毒液,加入完全培養基,于37℃、5% CO2中培養48 h；棄上清,PBS洗滌2次,加入4%多聚甲醛固定15 min；去除固定液,使用5% BSA 37℃封閉1 h；PBS洗滌5次，加入PBST稀釋的兔抗MAP2抗體(1∶200),4℃過夜；PBST洗滌5次，加入PBST稀釋的FITC標記的RABV-N蛋白單抗(1∶200)、伊文斯蘭(1∶300),Alexa Fluor 594標記的羊抗兔lgG(1∶1 000),37℃溫箱孵育1 h；PBST洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 RABV在小鼠原代神經元細胞中的復制

1.4.1直接免疫熒光觀察RABV增殖情況 將分離的原代神經元細胞接種于48孔板培養5～7 d,待原代神經元細胞生長狀態良好時,棄去培養基,PBS洗2次；將RABV以MOI=0.1的劑量接種于細胞,置于37℃、5% CO2培養箱中孵育1 h；棄去病毒液,加入完全培養基,于37℃、5% CO2培養箱中培養；接毒后，每隔12 h做1次直免,觀察病毒復制情況，直至72 h；首先棄去細胞培養基,每孔加-20℃預冷的80%丙酮溶液300 μL/孔,室溫固定30 min；棄去固定液,加入PBST 300 μL/孔,室溫搖床洗滌3次,每次5 min；避光條件下,用PBST將FITC標記的RABV-N蛋白單抗200倍稀釋,伊文斯蘭300倍稀釋,按100 μL/孔加入48孔板內,避光置于37℃、5% CO2培養箱中孵育1 h；棄去抗體,PBST搖床洗滌3次,每次5 min，置于熒光顯微鏡下觀察結果。

1.4.2Western blot檢測RABV-N蛋白的表達 將RABV以MOI=0.1的劑量接種于生長狀態良好的原代神經元細胞,每12 h提取細胞總蛋白,直至72 h；將原代神經元細胞用RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑)冰上裂解40 min；用細胞刮刀小心刮取細胞樣品，14 000×g離心10 min,吸取上清。蛋白樣品經12% SDS-PAGE分離后,電轉至NC膜,室溫封閉120 min；加入Bif-1一抗(1∶1 000稀釋),4℃孵育過夜；PBST洗滌5次，加入HRP標記的羊抗鼠二抗(1∶20 000稀釋),室溫孵育90 min；PBST洗滌5次，加入顯色液，化學發光儀進行曝光，回收NC膜,用二蒸水洗滌5 min；使用一、二抗去除液室溫孵育NC膜10 min,PBST洗滌5次；重新封閉,并孵育抗體，其中一抗為β-actin內參抗體(1∶10 000稀釋)。

1.4.3染料法熒光定量PCR擴增RABV基因組 將RABV以MOI=0.1的劑量接種于生長狀態良好的原代神經元細胞,每12 h反復凍融收取病毒上清液,直至72 h；使用TianGen病毒RNA提取試劑盒提取總RNA；參照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書,將提取的RNA反轉錄成cDNA；使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行熒光定量PCR。反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL,RV-N-F(10 μmol/L) 1 μL,RV-N-R(10 μmol/L) 1 μL,cDNA(500 ng)2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環。在檢測樣本的同時以已知濃度的pcDNA3.1-N質粒為模板制作標準曲線,記錄每個樣品的Ct值并代入標準曲線公式中,換算成RABV基因組拷貝數,結果以拷貝數/500 ng 病毒RNA表示。

1.4.4RABV TCID50測定 將生長狀態良好的NA細胞正常傳代,將細胞按100 μL/孔鋪至96孔板內,置于37℃、5% CO2培養箱備用。將待檢的病毒液用含10% FBS的DMEM進行10倍倍比稀釋,每個樣品做4組重復；將稀釋好的病毒液按50 μL/孔加入96孔板內,置于37℃、5% CO2培養箱中培養48 h；棄去細胞培養液,每孔加-20℃預冷的80%丙酮溶液150 μL/孔,室溫固定30 min；棄去固定液,加入PBST 150 μL/孔,室溫搖床洗滌3次,每次5 min；PBST稀釋FITC標記的RABV-N蛋白單抗(1∶200)、伊文斯蘭(1∶300),按50 μL/孔加入96孔板內,避光置于37℃、5% CO2培養箱中孵育1 h；棄去抗體,PBST洗滌3次,每次5 min；最后一次將PBST拍凈，置于熒光顯微鏡下觀察,用Reed-Muench法計算病毒滴度,結果以lg TCID50/mL表示。

1.5 Bif-1蛋白表達水平檢測將RABV以MOI=0.1的劑量接種于生長狀態良好的原代神經元細胞,每12 h提取細胞總蛋白,直至72 h；將原代神經元細胞用RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑)冰上裂解40 min；用細胞刮刀小心刮取細胞樣品,14 000×g離心10 min,吸取上清。蛋白樣品經12% SDS-PAGE分離后,電轉移至NC膜,室溫封閉120 min；加入Bif-1一抗(1∶1 000稀釋),4℃孵育過夜；PBST洗滌5次，加入HRP標記的抗鼠二抗(1∶20 000稀釋),室溫孵育90 min；PBST洗滌5次，回收NC膜,用二蒸水洗滌5 min；使用一、二抗去除液室溫孵育NC膜10 min,PBST洗滌5次，重新封閉,并重新孵育抗體,其中一抗為β-actin內參抗體(1∶10 000稀釋)。

2 結果

2.1 RABV感染小鼠原代神經元細胞將胎鼠大腦皮質分離獲得的神經元細胞進行培養,并于2，4，6 d觀察細胞形態。培養2 d后(圖1A),可見少量細胞軸突變長,并生長出許多樹突,且胞體膨大。培養至4 d后(圖1B),膠質細胞脫落,貼壁細胞軸突增多、伸長,細胞間開始出現少量連接,逐漸形成神經細胞網絡。培養6 d后(圖1C),細胞胞體變大,軸突樹突相互連接,形成神經網絡,立體感較強。

A.培養2 d;B.培養4 d；C.培養6 d;D.MAP2標記的紅色細胞即為原代神經元細胞；E.FITC標記RABV-N蛋白抗體

將RABV按MOI=0.1接種于神經元細胞,并用神經元細胞特異性抗體MAP2進行鑒定,觀察病毒感染情況及分布。MAP2標記的紅色細胞即為原代神經元細胞(圖1D)。FITC標記的RABV-N蛋白抗體檢測RABV感染情況及病毒分布，結果顯示，RABV能夠感染原代神經元細胞,在胞體及軸突均有分布,且神經元軸突出現串珠樣神經病變(圖1E)。

2.2 RABV在神經元細胞中的復制將RABV以MOI=0.1的劑量感染原代神經元細胞,經熒光顯微鏡觀察,病毒感染12 h后,無明顯熒光斑點；在24～48 h 熒光斑點逐漸增多、變大,并在48 h達到較高水平；病毒在60～72 h進一步復制,熒光斑點遍布整個視野(圖2A)。Western blot結果顯示,在接毒36 h后,可檢測出RABVN蛋白條帶,且72 h處灰密度較高(圖2B)；接種病毒后檢測神經元細胞中病毒N蛋白mRNA水平(圖2C)及上清中子代(圖2D)病毒載量,結果顯示,接毒后24 h細胞中病毒基因組及子代病毒滴度均逐漸上升,48 h顯著升高。

A.熒光顯微鏡觀察；B.Western blot結果；C.N蛋白mRNA水平；D.上清中子代病毒載量

2.3 Bif-1蛋白的表達分析通過對不同時間點提取的蛋白樣品進行Western blot檢測(圖3A)并對檢測條帶進行灰度值分析(圖3B)。結果顯示,RABV感染原代神經元細胞后,隨著RABV的復制,Bif-1蛋白表達在病毒感染24 h內出現短期上升后,在36 h出現短暫下降后上升,并在48 h處趨于正常水平；在病毒感染60～72 h后Bif-1蛋白及內參蛋白均出現明顯降低,且Bif-1蛋白在72 h無明顯條帶。在病毒感染72 h后,β-actin表達量降低,該結果提示，RABV CVS-11株對原代神經元細胞具有較強的神經噬性,從而破壞了細胞骨架結構的完整性。

A.Western blot檢測；B.條帶灰度值分析(#示P>0.05；*示P<0.05，**示P<0.01，***示P< 0.001)

3 討論

RABV屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridaefamily)RABV屬(Lyssavirusgenus),是極具致命性的嗜神經性病毒。RABV能夠特異性感染神經元并通過逆行軸突運輸在宿主神經系統中傳播。SUNDARAMOORTHY等[12]發現SARM1能夠促進狂犬病誘導神經細胞的突觸變性,而這種突觸變性阻礙了RABV在神經細胞間的傳播。AHMAD等[13-14]發現RABV感染使微管和肌動蛋白相關蛋白下調,從而破壞細胞骨架結構的完整性,造成神經元變性,引起突觸功能障礙,表現出神經功能異常。FABER等[15]研究發現過表達RABV G蛋白使神經元細胞凋亡程度增加,且凋亡程度直接決定抗體反應程度。PULMANAUSAHAKUL等[16]研究發現過表達細胞色素C使神經元細胞凋亡程度增加,降低了RABV的致病性,并增強了抗病毒免疫反應。

Bif-1是吞蛋白B蛋白家族(the endophilin protein family)的一員,由基因SH3GLB1編碼產生。研究表明,由于mRNA的選擇性剪接,Bif-1至少存在a、b、c、d、e五種亞型[5]。目前關于Bif-1a、Bif-1b、Bif-1c三種亞型的研究較多。研究表明,Bif-1是一種促凋亡蛋白[1，4],具有促進線粒體分裂的作用[17-18]。TAKAHASHI等[2，18]發現Bif-1a通過調節PI3KC3信號通路參與細胞自噬；過表達Bif-1a能夠改變Bax蛋白構象,激活Caspase-3蛋白,促進細胞凋亡的發生。WANG等[5]發現“神經特異性”Bif-1b/c能夠維持線粒體的形態并促進神經元的存活；Bif-1b/c與阿爾茨海默病的病理有關,Bif-1b/c缺失能夠導致β-淀粉樣蛋白沉積、斑塊形成、突觸變性、tau過度磷酸化；過表達Bif-1b/c能夠降低神經細胞的凋亡及β-淀粉樣蛋白的毒性,從而促進神經細胞的存活[10]。GAN等[7]發現Bif-1a在轉移性前列腺癌中具有促凋亡作用；Bif-1b/c具有抵抗由抗癌治療而產生的細胞凋亡作用,使轉移性前列腺癌向治療性神經內分泌前列腺癌轉變。因此,Bif-1a和Bif-1b/c在不同細胞中的“特異性”使其在癌癥、神經性疾病的治療方面極具前景。

本實驗室前期研究表明,在NA細胞中,過表達Bif-1c能夠抑制RABV的復制；過表達Bif-1c亞型促進RABV(CVS-11株)誘導的不完整自噬流并抵抗其誘導的細胞凋亡[19]。但目前尚無在原代神經元細胞上研究RABV與Bif-1蛋白相互關系的報道。因此本試驗建立了RABV CVS-11株感染小鼠原代神經元細胞模型，經Western blot檢測,RABV感染原代神經元細胞后,Bif-1蛋白水平表達有所變化,推測在原代神經元細胞中,Bif-1可能參與了RABV的感染過程。在本試驗中發現RABV感染使神經細胞GAPDH、β-actin、β-tubulin的表達降低,該結果提示RABV感染破壞了神經元細胞骨架結構的完整性,與相關研究報道[13-14，20-21]結果相似。下一步將通過Bif-1蛋白的過表達及基因敲除探索Bif-1對RABV復制的影響,為RABV致病機制和救治藥物研究奠定基礎。