羊源霍氏腸桿菌的鑒定和生物學(xué)特性分析

張 玲，王 利*，魏 勇，張楠馳

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部和四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川省畜牧科學(xué)研究院 獸醫(yī)研究所，四川 成都 610041)

霍氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，腸桿菌屬(Enterobacter)[1]。霍氏腸桿菌為革蘭陰性、短桿狀、周生鞭毛、兼性厭氧，1989年獨(dú)立成屬，屬于條件性致病菌[2-4]。目前，國內(nèi)外對此菌的報道尚少，僅從狐貍[2]、牛[5]、林麝[6]、海龜[7]、白蟻[8]、瓜實(shí)蠅[9]等動物和人[4]中被分離鑒定出。霍氏腸桿菌對動物和人具有一定的致病性，主要危害有菌血癥[1]、化膿性子宮內(nèi)膜炎[2]、肺炎、化膿性疾病[10]和腦卒[11]等。CAMPOS等[12]鑒定出此菌引起早產(chǎn)兒血液感染。至今為止，在羊中尚未見霍氏腸桿菌的報道，本研究從患病山羊腹瀉糞便樣中分離鑒定到霍氏腸桿菌菌株ztl-01，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，對防制霍氏腸桿菌導(dǎo)致的疾病有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 樣品采自四川省某山羊養(yǎng)殖場的腹瀉山羊糞便樣品。病羊眼結(jié)膜充血、體溫升高、四肢無力、呈現(xiàn)腹式呼吸并出現(xiàn)劇烈腹瀉，糞便惡臭呈水樣。剖檢發(fā)現(xiàn)主要病理癥狀為肝臟和腎臟腫大并有很多出血點(diǎn)、大腸小腸充血、腸黏膜脫落、全身淋巴結(jié)普遍腫大充血。

1.2 主要試劑與儀器LB培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京TIANGEN公司；藥敏紙片、腸桿科細(xì)菌生化鑒定管均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR儀購自Eppendorf Germany公司；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀均購自Bio-Rad公司。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定在超凈工作臺內(nèi)，無菌劃線接種于LB固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，挑取外觀一致的單菌落純化培養(yǎng)、革蘭染色和鏡檢。參照尹夢雅[13]、《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[14]和生化管使用說明進(jìn)行生理生化鑒定，提取細(xì)菌DNA進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增與測序。PCR反應(yīng)體系25 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸2 min。將拼接的完整序列在NCBI上進(jìn)行Blast序列比對，采用MegAlign軟件進(jìn)行16S rDNA基因同源性分析，采用Mega 6.0軟件對同源性相近的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 毒力基因檢測參照文獻(xiàn)[15-16]毒力基因引物，進(jìn)行ompX、cpa、hly、sip、afa、fimH、papA和papC共8種毒力基因的檢測。PCR反應(yīng)體系與程序同1.3。ompX、cpa、hly、sip、afa、fimH、papA和papC的退火溫度分別為59.0,64.0,59.6,57.0,55.0,57.0,58.0,60.0℃ 10 s，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.5 致病性試驗(yàn)將30只SPF小鼠(購自四川省成都市中醫(yī)藥研究所)隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，每組15只。試驗(yàn)前小鼠禁食、禁水24 h，試驗(yàn)組和對照組分別注射0.2 mL的1×109CFU/mL的ztl-01菌懸液和無菌生理鹽水。2組分開正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d。剖檢病死小鼠，取肝臟、脾臟、腎臟、腸組織于4%的多聚甲醛固定，制作病理切片。

1.6 動物回歸試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[17]方法對山羊進(jìn)行靜脈攻毒，將6只3月齡、體質(zhì)量14 ～16 kg的健康山羊隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，每組3只，試驗(yàn)組每只山羊通過耳靜脈接種2 mL的2×109CFU/mL的ztl-01菌懸液，對照組每只通過耳靜脈接種2 mL 的無菌生理鹽水。2組分開正常飼養(yǎng)，觀察、記錄至7 d，分析該分離菌對山羊的致病性。

1.7 耐藥基因檢測參照文獻(xiàn)[18-20]的4種氨基糖苷類藥物耐藥基因引物、3種磺胺類藥物耐藥基因引物及1種β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因引物，以提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同1.3，PCR反應(yīng)條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，耐藥基因(aph(3′)-Ⅱa、aac(3)-Ⅱa、aac(6′)-Ⅰb、ant(3′′)-Ⅰa、Sul1、Sul2、Sul3、TEM 的退火溫度分別為55.8，50.5，55.3，56.0，60.0，56.0，57.8，55.8℃ 10 s，72℃延伸30 s，共39個循環(huán)；最后72℃延伸2 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 藥敏試驗(yàn)采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法，取適量菌液均勻涂布于Mueller-HingtonAgar培養(yǎng)基上，將藥敏紙片在培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)16～18 h。本試驗(yàn)測量23種藥物對分離菌的抑菌圈直徑(IZD)，重復(fù)3次，取其平均值，根據(jù)WST125-1999紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)與指南判定結(jié)果。

1.9 生物被膜檢測參照文獻(xiàn)[15,21]采用2種方法進(jìn)行細(xì)菌生物被膜能力檢測，其中試管法定性檢測，微孔板法定量檢測，并檢測不同NaCl質(zhì)量濃度對霍氏腸桿菌生物被膜形成影響。在96孔板中分別加入含不同NaCl質(zhì)量濃度(1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 g/L)的TSB培養(yǎng)基，其余步驟同微孔板法，用不接菌的TSB培養(yǎng)基作為空白陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定多次純化后的單菌落呈圓形，中央微凸，邊緣整齊，乳白色，半透明或不透明。革蘭染色菌體呈紅色短桿狀，表明此菌為革蘭陰性菌(圖1)。葡萄糖、果糖、β-半乳糖苷(ONPG)、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、蛋白胨水(靛基質(zhì))、DNA、硝酸鹽(還原)、丙二酸鹽、醋酸鹽、甘露醇、黏液酸、乙酰胺、明膠液化陽性；木糖、阿拉伯糖、枸櫞酸鹽、尿素均呈陰性。綜合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)分離菌株與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[22]中霍氏腸桿菌的描述基本一致，初步鑒定為霍氏腸桿菌，并命名為ztl-01。經(jīng)16S rDNA基因擴(kuò)增并測序，獲得長度為1 458 bp 的片段(圖2)(GenBank:MN880393)，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。綜合判定ztl-01為霍氏腸桿菌。

圖1 革蘭染色結(jié)果(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker;1.16S rDNA基因擴(kuò)增;2.陰性對照

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 毒力因子檢測對ztl-01進(jìn)行毒力基因PCR擴(kuò)增檢測出毒力基因cpa、fimH(圖4)，其單一條帶與預(yù)期大小一致，其他6種毒力基因ompX、hly、sip、afa、papA、papC均未檢出。

2.3 致病性試驗(yàn)攻毒后12 h,15只試驗(yàn)組小鼠其中12只出現(xiàn)身體發(fā)抖、體溫升高的癥狀,并在24 h后出現(xiàn)腹式呼吸、腹瀉，48 h后試驗(yàn)組3只腹瀉小鼠死亡；剩余3只小鼠無臨床癥狀。對照組小鼠也無臨床癥狀。試驗(yàn)組小鼠的腸、肝臟、腎臟、脾臟均出現(xiàn)病變：腸黏膜水腫、絨毛縮短、部分上皮細(xì)胞壞死脫落，淋巴細(xì)胞浸潤，空腸和盲腸絨毛斷裂明顯，十二指腸和空腸充血明顯，回腸淋巴細(xì)胞浸潤；肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞變性，肝竇充血；腎小管上皮細(xì)胞變性，管腔狹窄；脾臟脾髓中紅髓區(qū)域中紅細(xì)胞增多，脾小體減少(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker;1.cpa;2.fimH

A.肝竇充血；B.脾髓中紅髓區(qū)域中紅細(xì)胞增多； C.十二指腸充血；D.空腸絨毛斷裂、充血；E.回腸淋巴細(xì)胞浸潤；F.盲腸絨毛斷裂

2.4 動物回歸試驗(yàn)試驗(yàn)組3只山羊接種后24 h均出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、厭食和伴隨輕微腹瀉癥狀，連續(xù)觀察到7 d無其他病癥出現(xiàn)，而對照組山羊在觀察期內(nèi)正常。無菌采集試驗(yàn)組山羊的糞便進(jìn)行細(xì)菌分離純化，再次分離鑒定出霍氏腸桿菌，表明該菌株對山羊有一定的致病性。

2.5 耐藥基因檢測耐藥基因TEM、aph(3′)-Ⅱa、Sul1的檢測結(jié)果與其PCR產(chǎn)物測序結(jié)果一致(圖6)，而耐藥基因aac(3)-Ⅱa、aac(6′)-Ⅰb、ant(3′′)-Ⅰa、Sul2、Sul3均未被檢出。

2.6 藥物敏感性結(jié)果顯示，ztl-01對阿莫西林、氨曲南、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢曲松、阿米卡星、頭孢唑啉、頭孢噻肟、磷霉素、拉氧頭孢、氧氟沙星、甲氧芐啶、慶大霉素敏感；對美洛西林、卡那霉素、多西環(huán)素中度敏感；對妥布霉素、氨芐西林/棒酸、磺胺甲基異惡唑、環(huán)丙沙星、氨芐青/舒巴坦、鏈霉素、諾氟沙星、氯唑青霉素、林可霉素、青霉素、克林霉素、氟苯尼考、紅霉素、麥迪霉素不敏感。磺胺類和氨基糖苷類耐藥基因檢測結(jié)果與耐藥表型結(jié)果基本一致，而β-內(nèi)酰胺類大多不一致(表1)。

M.DL2000 DNA Marker；1.TEM；2.aph(3′)-Ⅱa；3.Sul1

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7 生物被膜檢測試管法檢測到該分離菌具有形成生物被膜的能力，微孔板法檢測分離菌株生物被膜形成能力強(qiáng)弱，按照判定標(biāo)準(zhǔn)，此菌D/ODC值為1.43，ODC

不同質(zhì)量濃度NaCl對霍氏腸桿菌的生物被膜形成具有促進(jìn)作用，并且隨著培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量濃度的增加，細(xì)菌的成膜能力增加(圖7)，表明NaCl質(zhì)量濃度對此菌成膜能力的促進(jìn)作用呈正相關(guān)。

圖7 NaCl質(zhì)量濃度對霍氏腸桿菌生物被膜的影響結(jié)果(n=3)

3 討論

目前，關(guān)于霍氏腸桿菌的分離鑒定報道較少，O’HARA 等[4]從病人的血液、傷口和痰液分離到與陰溝腸桿菌和溶解腸桿菌親緣關(guān)系最近的霍氏腸桿菌。在國內(nèi)從1例腦卒患者痰液中分離鑒定到1株霍氏腸桿菌[11]。DAPHNE等[7]從海龜左腕關(guān)節(jié)滑液中分離到霍氏腸桿菌。李璐瑤等[3]從腹瀉仔豬糞便中分離到1株霍氏腸桿菌。溫珊珊等[2]從發(fā)病狐貍的子宮內(nèi)膿液中分離到霍氏腸桿菌，16S rDNA片段長度約為1 500 bp，能發(fā)酵木糖、甘露醇等。程建國等[10]從患肺炎的林麝肺部病料中運(yùn)用常規(guī)鑒定和16S rDNA PCR方法分離鑒定到16S rDNA片段長度約為1 600 bp的霍氏腸桿菌。本試驗(yàn)從四川某養(yǎng)殖場的腹瀉山羊糞便中分離鑒定1株霍氏腸桿菌菌株ztl-01。菌株ztl-01不能發(fā)酵木糖，能發(fā)酵甘露醇，與以上報道結(jié)果有差異，可能由于菌株來源環(huán)境與分離條件不同，并提示霍氏腸桿菌的分布環(huán)境廣泛。

目前，霍氏腸桿菌對人和動物均具有一定的致病性。霍氏腸桿菌可引起人體血液感染(BSIs)[23-25]。霍氏腸桿菌能導(dǎo)致斷奶小牛呼吸道感染并死亡，肺組織肺泡隔膜周圍的紅細(xì)胞滲血和隔膜增厚，炎性細(xì)胞浸潤[5]。霍氏腸桿菌是野生與圈養(yǎng)海龜?shù)闹匾≡w[7]。霍氏腸桿菌也可能導(dǎo)致狐貍的化膿性子宮內(nèi)膜炎[2]和林麝肺炎[10]。從病犬、貓[26]分離的大腸桿菌攜帶的黏附相關(guān)毒力因子fimH主要引起其尿路感染，在同屬的坂崎腸桿菌中，血漿纖溶酶原激活物基因cpa與該菌的傳播和侵入相關(guān)[27]。本試驗(yàn)檢測到霍氏腸桿菌cpa、fimH毒力因子，推測與此菌的傳播和感染相關(guān)，該菌對小鼠具有一定致病性，與上述報道的致病性研究結(jié)果相似，消化道與肝臟為主要病變器官。此菌對山羊具有一定致病性，主要導(dǎo)致體溫升高、腹瀉等，從而推測此菌的感染可以引起山羊腹瀉。至今尚未發(fā)現(xiàn)霍氏腸桿菌感染與山羊腹瀉有關(guān)的報道，本研究結(jié)果提示該菌有更廣泛的宿主范圍。

細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)外界環(huán)境，自身產(chǎn)生的胞外多聚物基質(zhì)包裹的膜狀細(xì)菌群體，能增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性，導(dǎo)致反復(fù)細(xì)菌性感染，大約85%的細(xì)菌性疾病與生物被膜形成有關(guān)[28-30]。香草酸可作為有潛力的治療霍氏腸桿菌感染藥物[31]。本試驗(yàn)中菌株ztl-01能形成生物被膜，屬于弱黏著菌株，說明該菌對抗生素和機(jī)體免疫系統(tǒng)具有一定的耐受性[32]。該菌株對14種抗生素耐藥，磺胺類和氨基糖苷類耐藥基因檢測結(jié)果與耐藥表型結(jié)果大體一致，而β-內(nèi)酰胺類大多不一致。這與O’HARA等[4]分離出來的菌株耐藥表型大部分相同。從小牛肺組織和鼻分泌物中分離的霍氏腸桿菌對喹諾酮類藥物具有敏感性[5]，而本研究中此菌對環(huán)丙沙星和諾氟沙星耐藥，對氧氟沙星敏感。與李璐瑤等[3]的藥敏結(jié)果也存在部分差異，前者對頭孢曲松、氨曲南、頭孢他啶具有耐藥性，而本研究中此菌對這些抗生素敏感。這些耐藥表型差異可能是由于細(xì)菌的宿主、環(huán)境、用藥情況不同而異，啟示應(yīng)選擇合適有效的抗生素治療感染動物。

本試驗(yàn)從腹瀉山羊糞便中分離到1株具有致病性和耐藥性的霍氏腸桿菌，可以輪換使用拉氧頭孢、氧氟沙星、阿米卡星等敏感抗生素進(jìn)行防控。