脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體的制備及間接競爭ELISA方法建立

孫亞寧，李青梅，楊蘇珍，胡驍飛，楊繼飛，張穎碩，陳琳琳，邢云瑞，鄧瑞廣，張改平,2*

(1 河南省農業科學院 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450002)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)，是一種主要由曲霉、青霉及鐮刀菌產生的單端孢霉烯族真菌毒素，在大麥、玉米、小麥、燕麥、黑麥等谷物、谷物制品及飼料中廣泛存在[1-2]，主要與小麥赤霉病和玉米穗腐病的發生有關，在我國長江、淮河、黃河等流域呈現多發態勢[3]，普通的加工和烹飪對其濃度沒有顯著影響[4]。DON的毒害作用主要干擾蛋白質和DNA的合成[5]，引起動物厭食癥、嘔吐、肌肉及腸出血、細胞毒性和免疫毒性等[6]，且與黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素有協同毒性[7]，嚴重危害動物[8]和人類身體健康，影響我國農業、畜牧業及食品安全的健康發展。很多國家對DON制定了嚴格的限量標準，我國《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量標準》中對谷物及其制品中DON的限量標準為不大于1 000 μg/kg[9]。能夠快速準確的檢測DON污染，是控制其危害的最有效手段。DON常用的檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜等大型儀器法及免疫學快速檢測方法等。薄層色譜法[10]主要用于快速定性檢測，檢測靈敏度較低；高效液相色譜等[11]大型儀器法檢測結果準確，為我國國標規定的仲裁法，但耗時較長且價格昂貴，不適合快速篩查；免疫學快速檢測方法主要包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)[12]、免疫層析法[13]、免疫傳感器法[14]等，由于具有快速、靈敏、特異、穩定、特別是操作簡單等特點，已經普遍應用于真菌毒素的快速檢測中[15-16]。建立DON免疫學快速檢測方法，制備敏感、特異的DON單克隆抗體是關鍵。本試驗通過N,N′-羰基二咪唑法制備人工抗原，優化免疫程序，通過單克隆抗體技術，控制關鍵點，制備靈敏、特異的單克隆抗體，并初步建立DON ELISA快速檢測方法，為DON免疫學快速檢測新技術的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑DON、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON)、黃曲霉毒素B1，青島普瑞邦生物工程有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，美國Amresco公司；雞卵清蛋白(OVA)，日本Wako公司；玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A(OTA)、伏馬菌素(FB1)、小鼠單抗亞型檢測試劑盒，美國Sigma公司；N,N′-羰基二咪唑，美國Aldrich公司；無水四氫呋喃，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、基礎培養基1640、選擇培養基HAT、HT、PEG-1500，美國Invitrogen公司；羊抗鼠酶標二抗(GAM-IgG-HRP)，美國Jackson公司；試驗用水為超純水，實驗室自制；NaOH等其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備3K-18高速冷凍離心機，德國Sigma公司；Bio-Rad-550型酶標儀，美國Bio-Rad公司；HI9321酸度計，美國Hanna公司；超凈工作臺，美國Forma Scientific公司；AE260電子天平，德國Mettler公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；PURELAB Classic UVF超純水儀，英國ELGA LabWater公司；93-3定時恒溫雙向磁力攪拌器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗動物SPF級8周齡雌性BALB/c小鼠購自鄭州大學醫學院實驗動物中心，由河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室飼養；小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0購自中國農業大學動物實驗室。

1.4 人工抗原的制備及鑒定分析DON分子結構(圖1)，選擇CDI法利用羥基偶聯蛋白制備人工抗原。稱取1.8 mg DON，加入400 μL無水四氫呋喃溶解，然后加入18 mg CDI，70℃控溫回流加熱至完全溶解；室溫反應1 h，旋轉蒸發儀蒸干，產物用100 μL 二甲基甲酰胺(DMF)溶解。稱取7 mg BSA溶解于500 μL PBS中，緩慢加入上述溶液，室溫攪拌反應2 h，PBS流動透析72 h，4℃、5 000 r/min離心10 min，去沉淀，上清液即為DON-BSA，-20℃保存備用，同法合成DON-OVA。參照文獻[17]紫外掃描法鑒定人工抗原。

圖1 DON的分子結構圖

1.5 動物免疫及融合備用鼠篩選取SPF級8周齡雌性BALB/c小鼠3只，采用皮下多點注射法免疫人工抗原DON-BSA，共免疫4次，免疫劑量為50 μg/只 200 μL，免疫間隔3周。首次免疫選用FCA與無菌PBS配制的人工抗原等量混合，乳化，后3次免疫佐劑改用FIA。4免1周后，小鼠斷尾采血，選用PBS 1∶100稀釋。用CBS稀釋包被原DON-OVA 為2 mg/L，50 μL/孔包被，37℃溫育2 h，PBST洗板4次(下同)；用5%豬血清PBST封閉，200 μL/孔，37℃溫育1 h，洗板；晾干密封后于4℃避光保存。間接ELISA鑒定小鼠多抗血清(pAb)中DON抗體的效價，間接競爭ELISA檢測抗體對DON的靈敏度。

1.5.1pAb效價的測定 參照文獻[18]間接ELISA方法測定pAb效價，加樣體積為100 μL/孔。取DON-OVA包被的酶標板，用5%豬血清PBST鋪底，第1孔加1∶100倍pAb，倍比稀釋至第7孔，設陰性對照(NC)，37℃溫育15 min，洗板；加GAM-IgG-HRP(1∶1 000倍用5%豬血清PBST稀釋)，37℃溫育30 min，洗板；加TMB顯色液室溫避光顯色5 min；2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀讀取D450值；以待測孔D450值≥陰性對照D450值的2.1倍(P/N≥2.1)，判為陽性。

1.5.2pAb敏感性鑒定 參照文獻[18]間接競爭ELISA方法鑒定其敏感性，加樣體積為100 μL/孔。取DON-OVA包被的酶標板，加D450值為1.3左右的小鼠血清和DON標準品(質量濃度為10.00,5.00,2.50,1.25,0.63,0.31,0.00 μg/L)作抑制劑，設陰性對照，37℃溫育15 min，洗板；加GAM-IgG-HRP(1∶1 000倍用5%豬血清PBST稀釋)，37℃溫育30 min，洗板；加TMB顯色液顯色5 min；2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀讀取D450值；計算抑制率(B/B0，B0為DON標準品濃度為0時D值，B為DON標準品不同濃度的D值),評價多抗血清靈敏度。

分析多抗血清ELISA檢測結果，增加第5次免疫，并檢測小鼠血清DON抗體效價及靈敏度，確定融合備用鼠。5免3周后對融合備用鼠進行加強免疫，取免疫原DON-BSA無菌PBS稀釋，免疫劑量為50 μg/只 200 μL，腹腔注射。免疫1周后小鼠斷尾采血，評價血清效價及靈敏度方法同上，當效價達到1×104及以上時安排細胞融合。

1.6 單克隆抗體制備確定融合備用鼠后準備細胞融合。首先進行SP2/0細胞復蘇及擴大培養，選用 RPMI-1640完全培養液培養，使其處于對數生長狀態；細胞融合前3 d，再次對融合備用鼠進行加強免疫，免疫方法及計量同1.5。融合前1～2 d制備小鼠飼養細胞；小鼠加強免疫后3～4 d，摘眼球分離陽性血清，脫頸致死小鼠。參照文獻[18]方法，選用50% PEG-1500為融合劑進行細胞融合；融合后用HAT培養基重懸，50 μL/孔 加入到提前準備的96孔飼養細胞培養板上，共鋪設5板，于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。5 d左右半量換液，7～10 d 取上清液進行陽性篩選。

陽性雜交瘤細胞株選用間接ELISA和間接競爭ELISA方法篩選，用PBS將細胞上清1∶4倍稀釋進行間接ELISA檢測，選取D450≥1.0的孔為陽性孔；然后對陽性孔細胞上清進行間接競爭ELISA檢測，選取靈敏度較好的孔轉孔擴大培養，經2～3次亞克隆后，篩選效價高、靈敏度好、生長旺盛的雜交瘤細胞株為DON單克隆細胞株，擴大培養并凍存。

選用體內誘生腹水法生產DON單克隆抗體(mAb)[20]，用辛酸/飽和硫酸銨法純化mAb[21]。

1.7 單克隆抗體免疫學性質鑒定及間接競爭ELISA檢測方法建立

1.7.1單克隆抗體亞型鑒定 用小鼠單抗亞型檢測試劑盒對DON單克隆抗體亞型進行鑒定[19]。

1.7.2單克隆抗體效價及靈敏度鑒定 鑒定DON單克隆抗體的效價和靈敏度首先應優化ELISA檢測方法的包被質量濃度，不同的包被質量濃度呈現出單克隆抗體的免疫學性質不同。選擇包被原DON-OVA分別以6.00,3.00,1.50,0.75,0.40,0.20 mg/L的量包被酶標板，分別測定不同包被質量濃度下抗體效價，選擇D450值在1.3左右的孔對應的抗體濃度作為抗體稀釋濃度，間接競爭ELISA(方法同1.5)檢測抗體對DON的靈敏度，繪制標準曲線計算IC50。選擇靈敏度最佳的抗原包被質量濃度為該ELISA檢測方法的包被質量濃度，抗體濃度為該ELISA檢測方法的抗體工作濃度，該包被質量濃度下相對應的抗體效價為DON單克隆抗體效價，包被質量濃度下測定的抗體靈敏度為DON單克隆抗體的靈敏度，并根據標準曲線計算ELISA檢測方法的檢測范圍(以抗體對DON的20%～80%抑制濃度范圍評價即IC20～IC80)[22]。

1.7.3單克隆抗體親和力的測定 選用BATTY等[23]建立的方法測定DON mAb親和常數(Ka)。選擇包被原DON-OVA 1.50，0.75 mg/L的質量濃度分別包被酶標板并用間接ELISA測定mAb效價，以mAb濃度為橫坐標，D450值為縱坐標，繪制間接ELISA反應曲線，按照公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)計算親和常數，其中n=[Ag]t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag′]t為2個不同的包被原質量濃度，[Ab]t、[Ab′]t為各包被原質量濃度下50%D450值對應的抗體濃度[24]。

1.7.4單克隆抗體特異性鑒定 選取DON的結構類似物3-AcDON和15-AcDON，以及其他的真菌毒素AFB1、OTA、ZEN、FB1作為交叉反應靶標物，各靶標物用甲醇配置成1 g/L的母液，PBS稀釋為所需質量濃度。間接競爭ELISA檢測抗體靈敏度，計算各靶標物IC50，根據公式CR=IC50/IC50′×100%計算各靶標物交叉反應率，其中IC50為抗體對DON的靈敏度，IC50′為抗體對各交叉反應靶標物的靈敏度[25]。

1.8 加標回收試驗選用PBS配置DON標準溶液100 mg/L，取陰性小麥樣品5份，粉碎后加入DON標準品，配置DON含量為1 000 μg/kg的小麥陽性樣品(國標限量)。小麥陽性樣品各取1 g/份于5 mL離心管中，加入2 mL PBS充分振蕩提取15 min，10 000 r/min離心3 min，上清液用PBS稀釋10倍后按照間接競爭ELISA檢測方法檢測，每份樣品重復檢測3次求取平均值計算小麥樣品中所含DON濃度，根據公式計算添加回收率(%)=檢測靶標物濃度/添加靶標物濃度×100%，回收率在100%±20%范圍內，變異系數(CV)小于15%，認為該檢測方法準確率高、穩定性好。

2 結果

2.1 人工抗原鑒定紫外掃描法鑒定人工抗原DON-BSA及DON-OVA，結果見圖2，與偶聯后的人工抗原紫外吸收曲線相比BSA蛋白紫外吸收曲線有所改變，偶聯后吸收峰具備了DON在220 nm處吸收峰的特點，而且在240～280 nm的吸收峰也有所增加，從而初步斷定DON人工抗原偶聯成功。

圖2 人工抗原紫外掃描圖譜

2.2 小鼠多抗血清測定間接ELISA法檢測小鼠多抗血清效價結果見表1，間接競爭ELISA檢測小鼠血清對DON靈敏度結果見表2。結果顯示，4免1周后3只小鼠均產生了針對DON的抗體，從而說明DON人工抗原制備成功。但3只小鼠效價均不高，1號鼠效價最高也僅有1∶3 200，若此時融合成功概率較小，為提高融合效率對小鼠進行5免，方法及劑量同4免。5免1周后采血鑒定血清效價及靈敏度，結果見表1，2，結果小鼠5免后抗體水平及抗體靈敏度均沒有明顯變化。3只小鼠中1號小鼠效價較高，抗體針對DON靈敏度較好，選擇1號小鼠進行免疫嘗試。將1號小鼠采用腹腔注射的方法加強免疫，1周后采血檢測血清效價及靈敏度，結果見表1，結果小鼠血清效價提升至1∶104，滿足細胞融合條件，但抗體靈敏度無明顯變化。小鼠腹腔免疫1個月后進行再次腹腔免疫，3 d后進行細胞融合，小鼠摘眼球采血收集血清檢測效價，結果顯示效價再次提高1個梯度。

表1 間接ELISA測定血清效價 D450值

表2 間接競爭ELISA測定血清靈敏度 D450值

2.3 單克隆抗體的制備

2.3.1雜交瘤細胞株篩選 細胞融合9 d后進行陽性孔篩選，間接ELISA檢測1∶4倍PBS稀釋的細胞上清，篩選D450值大于1.0的孔23孔，對23孔進行靈敏度檢測，獲得陽性孔13孔。將陽性孔擴大培養，經3次亞克隆后獲得2A3-E11單克隆細胞1株，經多次傳代，該細胞株能穩定分泌DON單克隆抗體。

2.3.2單克隆抗體的制備 選用體內誘生腹水法制備DON單克隆抗體，注射小鼠3只，收獲腹水約10 mL。辛酸/硫酸銨法純化，PBS透析，-40℃凍存。

2.4 單克隆抗體免疫學性質鑒定

2.4.1單克隆抗體亞型鑒定 用小鼠單抗亞型檢測試劑盒對DON單克隆抗體亞型進行鑒定，結果顯示DON 2A3-E11株單克隆抗體為IgG1型。

2.4.2單克隆抗體效價及靈敏度測定 分別用6.00,3.00,1.50,0.75,0.40,0.20 mg/L的包被原DON-OVA包被酶標板，不同包被質量濃度下DON單克隆抗體效價結果見表3，不同包被質量濃度下DON單抗靈敏度檢測結果見圖3。結果顯示，當包被質量濃度為0.20，0.40 mg/L 時抗體靈敏度最好，但0.20 mg/L包被時抗體效價偏低，故選擇0.40 mg/L 為最佳包被質量濃度。該質量濃度下DON單克隆抗體效價可達1∶1 024 000；一抗工作濃度為45 000倍稀釋。

表3 不同酶標板包被質量濃度下DON單克隆抗體效價測定結果 D450值

圖3 不同包被質量濃度下DON單克隆抗體靈敏度

間接競爭ELISA檢測DON單克隆抗體靈敏度結果見圖4，以DON標準品濃度對數值為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為y=-0.454 7x+1.105 0，回歸系數R2=0.990 7，根據回歸方程計算IC50為21.507 9 μg/L，檢測范圍為4.696 8～98.490 0 μg/L。

圖4 DON單克隆抗體靈敏度標準曲線

2.4.3單克隆抗體親和力鑒定 DON單克隆抗體親和力測定結果見圖5，經計算[Ab]t、[Ab′]t分別為3.16×10-10,8.044×10-11mol/L，親和常數為9.064×108mol/L，說明本試驗制備的DON單克隆抗體具有很好的親和力。

圖5 DON單克隆抗體親和常數測定曲線

2.4.4單克隆抗體特異性鑒定 DON單克隆抗體特異性結果見表4。結果獲得的單克隆抗體與15-AcDON有233.70%的交叉反應，與3-AcDON及其他常見的真菌毒素無明顯交叉反應，說明制備的DON單克隆抗體具有很好的特異性。

表4 DON單克隆抗體特異性鑒定結果

2.5 加標回收試驗DON間接競爭ELISA檢測方法的加標回收試驗結果見表5，檢測小麥樣品5份，添加回收率為90.509%～116.016%，平均值為103.989%；CV為3.081%～7.928%，平均值為5.633%，說明該檢測方法準確率高、結果可靠。

表5 加標回收試驗結果(n=3)

3 討論

DON屬于真菌毒素，其相對分子質量為296.32屬于小分子抗原，只具有反應原性，無免疫原性，因此稱為半抗原。獲得半抗原的單克隆抗體首先需要將小分子與大分子的蛋白質依靠化學鍵連接在一起形成人工抗原，制備的人工抗原既包含小分子的結構，又具有免疫原性。CDI是咪唑的衍生物，能與氨、醇、酸等官能團反應，且具有高度的選擇性[26]。本研究將DON與常用的載體蛋白BSA和OVA利用CDI法僅一步進行偶聯，避免了改造過程中的副反應影響[27]，偶聯過程簡單高效，經鑒定成功制備了DON的人工抗原，且具有很好的免疫原性及反應原性。由于CDI遇水分解，因此人工抗原制備過程中水的存在對偶聯影響較大，應注意試劑及環境中水份的控制。

本試驗采用傳統的弗氏佐劑與DON人工抗原乳化后進行皮下多點注射法免疫小鼠，經過4次免疫后抗體效價偏低，如果繼續融合可能會導致融合失敗，因此進行了第5次常規免疫，但抗體水平沒有明顯提升。因皮下注射抗原緩慢釋放形成持久刺激，同樣劑量和手段進行再次免疫不能對免疫細胞形成刺激提高效價。有資料顯示腹腔注射在短時間內大量注入抗原會刺激B淋巴細胞迅速增殖產生大量抗體使多抗血清效價升高[28]，因此為了提高小鼠抗體效價，提高融合成功率，本試驗嘗試腹腔無佐劑注射來提高小鼠抗體效價。經2次腹腔免疫后多抗血清效價提高了3～4個梯度獲得了較好的結果，為單克隆抗體制備過程中小鼠效價低的問題提供了較好的解決途徑，對單克隆抗體制備方法的改進及完善具有重要的意義。

近年來，很多國內學者制備DON單克隆抗體，曹娟[29]制備的DON單克隆抗體IC50為1.05 mg/L；張勛[30]制備的DON單克隆抗體IC50為31.6 μg/L；張榮升[31]制備的DON單克隆抗體IC50為119.4 μg/L。本試驗制備的DON單克隆抗體對DON的IC50為21.501 9 μg/L，靈敏度有了較大地提升。本試驗免疫小鼠的多抗血清對DON的IC50約為1 mg/L，而經過雜交瘤細胞的篩選后，獲得的靈敏度提高了約50倍，結果表明，多克隆抗體的靈敏度較差時也有可能篩選出靈敏度較好的單克隆抗體，本試驗結果對單克隆抗體的篩選過程具有一定的參考價值。

DON有兩種乙?；Y構類似物3-AcDON和15-AcDON，可以通過抗體與兩種結構類似物的反應推測單抗的抗原結合位點。張榮升[31]用琥珀酸酐法制備的人工抗原3-HS-BSA免疫小鼠制備的DON抗體與3-AcDON有很好的反應性，而與15-AcDON未見明顯反應。本試驗制備的DON單克隆抗體與15-AcDON有233.70%的交叉反應，則可印證本試驗改造的可能是DON上C15位羥基，因此人工抗原與15-AcDON結構更為相似，制備的抗體與15-AcDON有更好的靈敏度；而與3-AcDON未見明顯交叉反應，說明制備的抗體可以有效識別C3位置上的羥基，這個基團為DON的主要致毒基團[32]，因此本試驗制備的抗體可以較好地識別具有毒性的DON結構，當DON上C3位羥基發生改變后抗體與它的反應能力下降或不再反應，因此該抗體在DON脫毒等領域也將有廣泛的應用[33]。

本試驗采用CDI一步法將DON與載體蛋白偶聯成功制備了人工抗原，并研究了不同的免疫方式對小鼠多抗血清效價的影響，發現了可以在免疫后期提高小鼠多克隆抗體效價的有效免疫手段。通過單克隆抗體技術獲得對DON特異、敏感、親和力高的單克隆抗體細胞1株，該細胞株分泌的抗體與之前報道的DON單克隆抗體相比具有較高的靈敏度(IC50為21.507 9 μg/L)，且可以有效識別DON的主要致毒基團C3位置上的羥基。基于該抗體建立的間接競爭ELISA方法檢測范圍為4.696 8～98.490 0 μg/L，可以實現DON的痕量檢測；小麥樣品中加標回收試驗證明該檢測方法準確率高、結果可靠，可進一步應用于小麥等谷物樣品中DON污染的檢測，為DON脫毒研究及免疫學快速檢測方法的建立奠定基礎。