坦布蘇病毒誘導昆明鼠脾細胞凋亡

提金鳳，李志杰，刁有祥，李 舫*

(1.山東畜牧獸醫職業學院，山東 濰坊 261061；2.山東農業大學 動物科技學院，山東 泰安 271018)

坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)感染是近年來我國新出現的一種以水禽感染為主的病毒性傳染病。雛鴨感染后表現為行動遲緩、癱瘓、倒地震顫等癥狀，產蛋鴨感染后表現為產蛋率下降，卵泡出血、破裂、形成卵黃性腹膜炎等特征，給水禽養殖業帶來了巨大的經濟損失[1-2]。TMUV最早是1955年從蚊子體內分離到的，其屬于黃病毒科、黃病毒屬、那他耶病毒群中的蚊媒類病毒[3-4]。黃病毒屬中大多數病毒屬于人獸共患病毒，如登革熱病毒(DENV)、流行性乙型腦炎病毒(JEV)、黃熱病毒(YFV)、西尼羅病毒(WNV)等，每年都會有數百萬人感染或死亡的病例報道，嚴重威脅著全世界人類的健康[5-6]。

細胞凋亡(apoptosis)是生物體重要的生理和病理現象，凋亡規律一旦失常，機體將出現病理現象[7-10]。邵周伍林等[11]研究發現，TMUV E蛋白在鴨胚成纖維細胞(DEF)表達過程中具有誘導宿主細胞發生凋亡的作用。據報道，BALB/c小鼠、昆明鼠均能通過腦內途徑接種感染TMUV，表現出明顯的臨床癥狀和病變[3,11]。TMUV還能引發BALB/c小鼠發生抗體依賴性感染[3]。為探討TMUV能否誘導哺乳動物細胞發生凋亡，本研究以昆明鼠作為實驗動物，采用不同檢測方法研究昆明鼠感染TMUV后誘導脾細胞凋亡的作用，初步探討TMUV與哺乳動物細胞的相互作用，進一步了解病毒的致病機制，為有效防制該病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及病毒3周齡雌性SPF級昆明鼠購自山東省實驗動物中心。鴨TMUV SDSG株由山東農業大學禽病研究所分離保存，該毒株為2013年從山東省某發病養鴨場的病死鴨體內分離(KJ740746)獲得。試驗組昆明鼠病毒的接種劑量為104.8ELD50/0.2 mL(ELD50：雞胚半數致死量)。

1.2 試劑細胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司；100 bp DNA Ladder購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖購自Sigma公司；高糖型DMEM購自海克隆公司；無支原體胎牛血清購自北京全士金生物技術有限公司；青/鏈霉素混合液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司；細胞培養瓶、細胞培養板購自美國康寧公司(Corning)；其他試劑均為國產分析純。

1.3 體內試驗30只3周齡雌性SPF級昆明鼠隨機分成2組，每組15只。其中試驗組采用腦內(I.c)途徑接種50 μL TMUV-SDSG病毒液(104.8ELD50/0.2 mL)，該接種劑量是通過預試驗確定的。陰性對照組于相同途徑接種50 μL無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，每天觀察小鼠臨床癥狀。分別于攻毒后3，5，7 d，每組隨機選擇5只小鼠安樂死，收集脾臟組織。據文獻報道[3,12]，TMUV只有通過腦內接種才能感染昆明鼠，昆明鼠感染后，脾臟是病變最明顯的組織器官，病毒載量高，因此本研究選擇脾細胞作為研究細胞凋亡的靶器官。

1.3.1DNA Ladder法檢測細胞凋亡 首先進行組織DNA的提取。將脾臟組織剪切成小塊，研缽中研碎或搗碎，按照細胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒說明書的要求加入適量的樣品裂解液，每毫升樣品裂解液應加入5 μL蛋白酶K，Vortex旋渦混勻器混勻，充分裂解組織。50℃水浴消化過夜12～20 h。加入500 μL Tris平衡苯酚(pH 8.0)，Vortex旋渦混勻器劇烈混勻，使有機相和水相充分混合，以達到抽提效果。4℃、12 000 r/min離心5 min。緩慢吸取上層水相，并用等體積Tris平衡酚再抽提1次。緩慢吸取約300 μL上清液，加入60 μL 10 mol/L 醋酸銨和600 μL無水乙醇，顛倒數次混勻，此時可見DNA沉淀產生。-20℃ 作用 1 h，以充分沉淀小片段DNA。-20℃過夜或-70℃ 作用效果更佳。4℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清。加入600 μL 70%乙醇，緩慢顛倒約2次。4℃、12 000 r/min 離心10 min，小心吸去上清。盡量除去殘余的乙醇，待看不到明顯的液體時，立即加入50～100 μL TE溶解DNA。

其次進行瓊脂糖凝膠電泳。取部分抽提的脾臟DNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳電壓采用50 V，電泳時間持續2 h左右。制膠時選取較薄的梳齒，加樣孔扁平，這樣會獲得更好的DNA Ladder電泳效果。

1.3.2采用流式細胞儀檢測細胞凋亡 無菌采集攻毒3，5，7 d后昆明鼠的脾臟，研磨后獲取脾細胞，紅細胞裂解液處理后，脾細胞采用1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS重懸細胞并計數。取(5～10)×104重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液，重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，然后加入10 μL PI染色液，混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。避光孵育過程中可重懸細胞2～3次，以改善染色效果。染色后，立即上流式細胞儀進行檢測。同時設置未染色組、PI單染組和Annexin V-FITC單染組作為對照。

無菌采集陰性對照組昆明鼠的脾臟，處理方法同上。

1.4 體外試驗無菌采集3周齡SPF昆明鼠的脾細胞，紅細胞裂解液處理后，用含10%小牛血清的1640細胞培養基懸浮，接種于24孔細胞板中，置于37℃細胞培養箱中進行培養。脾細胞培養24 h后，每孔接種0.2 mL TMUV-SDSG，病毒吸附1 h后，棄掉細胞上清，加入含10%小牛血清的1640細胞培養基繼續培養。同時設立未接種TMUV的脾細胞作為陰性對照組。

1.4.1流式細胞儀檢測細胞凋亡 分別收集接種TMUV-SDSG后繼續培養24，48 h的脾細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細胞并計數。取(5～10)×104重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液，重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。加入10 μL PI染色液，混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。避光孵育過程中可重懸細胞2～3次，以改善染色效果。染色后，立即上流式細胞儀進行檢測。Annexin V-FITC染色后為綠色熒光，PI染色后為紅色熒光。同時設立未染色組、PI單染組和Annexin V-FITC單染組作為對照。

由于脾細胞培養72 h后，死亡細胞數目過多，因此只收集了24，48 h的脾細胞進行檢測。

1.4.2熒光顯微鏡觀察細胞凋亡 脾細胞經Annexin V-FITC和PI染色后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用50～100 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，細胞涂片，熒光顯微鏡下觀察。設立未染色組和PI單染組作為對照。

1.5 數據分析流式細胞儀檢測脾細胞凋亡時，每個時間點均選擇5個攻毒樣本和5個對照樣本進行檢測，每個樣本均檢測3次。檢測結果運用軟件Graph Prism進行分析，方法采用單向方差分析法即Tukey's post-test法(差異顯著：P<0.05；差異極顯著：P<0.01)。

2 結果

2.1 體內試驗

2.1.1DNA Ladder法檢測細胞凋亡 分別取攻毒TMUV-SDSG后3，5，7 d昆明鼠的脾臟，DNA ladder試劑盒處理后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示。昆明鼠攻毒后3 d，脾臟組織沒有出現DNA Ladder圖譜，攻毒后5，7 d，脾臟組織出現了明顯的梯狀DNA Ladder圖譜。陰性對照組均沒有出現DNA Ladder圖譜。

M.100 bp DNA Marker ；1～3.攻毒后3，5，7 d昆明鼠脾臟DNA Ladder；4～6.陰性對照組小鼠脾臟DNA Ladder

2.1.2流式細胞儀檢測細胞凋亡 無菌采集攻毒后3，5，7 d昆明鼠的脾細胞，紅細胞裂解液處理后，Annexin V-FITC和PI染色，流式細胞儀檢測凋亡細胞，結果如圖2所示。

昆明鼠攻毒TMUV后3 d，脾細胞中凋亡細胞比例為49.30%(圖2A)，對照組健康昆明鼠脾細胞中凋亡細胞比例為36.44%(圖2B)，攻毒組與對照組差異顯著(圖2G，P<0.05)。昆明鼠攻毒TMUV后5 d，脾細胞中凋亡細胞比例為53.76%(圖2C),對照組健康昆明鼠脾細胞中凋亡細胞比例為43.84%(圖2D)，攻毒組與對照組差異顯著(圖2G，P<0.05)。昆明鼠攻毒TMUV后7 d，脾細胞中凋亡細胞比例為68.62%(圖2E),對照組健康昆明鼠脾細胞中凋亡細胞比例為31.72%(圖2F)，攻毒組與對照組差異極顯著(圖2G，P<0.01)。

A,C,E.分別為昆明鼠感染TMUV后3，5，7 d的脾細胞凋亡細胞比例；B,D,F.分別為對照組健康昆明鼠脾細胞凋亡細胞比例；G.凋亡細胞的比例,誤差線表示樣本平均數的標準偏差(n=3)，a與b表示不同時間點攻毒組和對照組統計學差異顯著(P<0.05，P<0.01)，計算采用單向方差分析法(Tukey's post-test)。下同

2.2 體外試驗

2.2.1流式細胞儀檢測細胞凋亡 分別收集接種TMUV后24，48 h昆明鼠的脾細胞，染色后，流式細胞儀檢測凋亡細胞，以健康昆明鼠的脾細胞作為對照。結果如圖3所示，感染TMUV后24 h的昆明鼠脾細胞中，凋亡細胞比例為27.9%(圖3A)，對照組昆明鼠脾細胞中凋亡細胞比例為16.1%(圖3B),試驗組和對照組相比差異顯著(圖3E，P<0.05)。感染TMUV后48 h的昆明鼠脾細胞中，凋亡細胞的比例為32.22%(圖3C),對照組昆明鼠脾細胞中凋亡細胞比例為25.26%(圖3D),試驗組和對照組相比差異顯著(圖3E，P<0.05)。

A，C.對照組脾細胞培養后24，48 h凋亡細胞的比例；B，D.脾細胞感染后TMUV 24，48 h凋亡細胞的比例；E.凋亡細胞的比例

2.2.2熒光顯微鏡觀察細胞凋亡 脾細胞經Annexin V-FITC和PI染色后，熒光顯微鏡下觀察，結果顯示，綠色熒光染色的為凋亡細胞，綠色和紅色熒光雙染色的是壞死細胞；其中脾細胞感染TMUV后48 h，凋亡細胞數目和死亡細胞數目比24 h更多。未染色對照組，沒有出現任何熒光(圖4)。

3 討論

TMUV最早在我國出現時，只有鴨感染發病，不到1年時間，該病毒迅速蔓延至鵝、雞和鳥類，可見該病毒傳播速度快，易感動物種類多。TMUV感染后主要引起產蛋禽的產蛋率下降，幼禽的神經癥狀等[13-15]。研究表明，TMUV感染蛋雞和鵝時，感染細胞短時間內便會發生細胞凋亡[16]。隨著TMUV不斷進化，可能會有更多種類的動物被感染，如哺乳動物等。關于TMUV與哺乳動物細胞之間相互作用的研究較少，誘導哺乳動物細胞凋亡的研究還尚未見報道。但黃病毒屬中其他病毒誘導宿主細胞凋亡的研究較多，如DENV、JEV、豬瘟病毒(CSFV)等。據報道，DENV能誘導人的血管內皮細胞發生凋亡，而且該凋亡與細胞受體Fas/FasL的表達改變有關[17-19]。本研究通過TMUV體內和體外2種方式感染昆明鼠脾細胞，觀察流式細胞儀和DNA Ladder的檢測結果，進一步評估該病毒誘導昆明鼠脾細胞的細胞凋亡作用。

A,E.脾細胞感染TMUV 24，48 h Annexin V-FITC染色結果；B,F.脾細胞感染TMUV 24，48 h PI染色結果；C,G.脾細胞感染TMUV 24，48 h Annexin V-FITC和PI染色后融合的結果；D,H.脾細胞感染TMUV 24，48 h未染色對照組

本研究的體內試驗是采用腦內接種途徑對昆明鼠進行攻毒后，對脾細胞凋亡情況進行檢測。DNA Ladder法檢測結果顯示，昆明鼠攻毒后3 d，脾臟組織沒有出現梯狀DNA Ladder，攻毒后5,7 d，脾臟組織出現了特異性的梯狀DNA Ladder圖譜。流式細胞儀檢測結果顯示，昆明鼠攻毒后3 d，脾細胞中凋亡細胞比例與對照組相比差異顯著；攻毒后5，7 d，脾細胞中凋亡細胞比例與對照組相比差異極顯著。這些數據充分表明，TMUV能夠誘導昆明鼠脾細胞發生凋亡。TMUV感染初期，細胞凋亡不明顯，感染時間延長，細胞凋亡越顯著。這與昆明鼠感染TMUV后發生病理變化和免疫抑制的規律是一致的[1]，從而進一步說明TMUV誘導昆明鼠脾細胞凋亡可能是導致脾臟病變及機體免疫抑制的重要因素之一。

據報道，CSFV的E蛋白與淋巴細胞孵育后，能抑制淋巴細胞蛋白質的合成和誘導細胞凋亡[20]。SATO等[21]經體外研究也證明了CSFV可以在脾組織細胞引起細胞凋亡[22]。JEV可以誘導小鼠發生明顯的細胞凋亡。本研究中，TMUV也表現出相似的特性。TMUV能誘導體外培養的昆明鼠脾細胞發生顯著的細胞凋亡。體外試驗中，脾細胞感染TMUV繼續培養，培養72 h，死亡脾細胞占絕大多數，因此本研究只選擇了2個時間點，即24，48 h進行檢測。流式細胞儀對Annexin V-FITC和PI染色后的脾細胞進行檢測，結果表明，TMUV感染24，48 h，凋亡細胞比例與對照組相比差異顯著，病毒感染時間延長，凋亡細胞的比例越顯著。這與體內試驗結果一致。熒光顯微鏡觀察V-FITC和PI染色后的脾細胞，結果顯示，TMUV感染24，48 h，均出現多量凋亡細胞，病毒感染時間與凋亡細胞比例的關系與前面試驗的結果一致。

本研究通過體內和體外試驗明確了TMUV感染昆明鼠后能誘導脾細胞發生顯著的細胞凋亡，為探討TMUV與易感動物細胞的作用機制、揭示其致病原理奠定了基礎，為有效防制該病提供了理論依據。