耐多藥結核病治療藥物及潛在藥物的結構和性質計算

李震岳，翁約約，，黃羅儀，王朝杰

1.溫州醫科大學定理臨床學院 溫州市中心醫院 藥劑科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

2020年WHO發布報告[1]稱，2019年全球新發結核病患者約996萬，新增150萬耐藥性結核病患者，包括單藥耐藥結核病（monodrug-resistant TB，MR-TB）、多耐藥結核病（polydrug-resistant TB，PR-TB）、耐多藥結核病（multidrug-resistant TB，MDR-TB）和廣泛耐藥結核病（extensively drugresistant TB，XDR-TB）等[2]。臨床常用抗結核藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素等，備選藥物有左氧氟沙星、莫西沙星和阿米卡星等[3]，但MDR-TB的全球平均治愈率僅維持在55%左右[4]。

隨著耐藥結核病患者的增多，研究和開發新的抗結核藥物已成為全球消除結核病的重要戰略組成部分。ZHAO等[5]報道了基于噁唑烷酮結構合成的17類86種化合物，通過系列體內和體外實驗發現，構象限制性的19c比目前臨床用于治療MDR-TB藥物利奈唑胺（Linezolid，Lin）[6]，正在進行臨床試驗的舒特唑胺（Sutezolid，Sut）[7]、德帕唑胺（Delpazolid，Del）[8]和TBI-223（223）[9]安全性和療效更佳。本研究將對上述五種化合物的結構和性質進行計算分析，探索內在關系，促進MDR-TB新藥研發。五種化合物的2D結構式見圖1。

圖1 五種化合物的2D結構式

1 計算方法

藥物分子構象采用MMFF94力場進行分子力學計算，在GaussView6.0中的附加模塊GMMX中實現。使用默認參數集，總能隙為3.5 kcal·mol-1。當超過10 000次試驗的限制，或經過50次連續試驗，仍沒有新的構象位于能量間隙內全局最低限度，則停止搜索。

理論計算采用密度泛函理論的M06-2X方法，在6-311+G（2d，p）基組水平上對圖1五種化合物在真空環境幾何結構和電子結構進行優化，再進行紅外（IR）振動光譜、紫外-可見（UV-Vis）吸收光譜、電子圓二色（ECD）譜計算。已有文獻[10]報道顯示，M06-2X這種雙雜化元廣義梯度近似方法（DH m-GGA）在預測分子幾何形狀、拉曼強度、熱化學和動力學、非共價相互作用等方面表現良好。在上述優化結構的基礎上，結合自洽反應場方法中的極化連續介質模型模擬環己烷（cyclohexane，Cyc）、水（water，Wat）和甲醇（methanol，Met）溶劑環境，再用同一基組水平的含時密度泛函理論進行UV-Vis吸收光譜和ECD譜計算，所得波函數用于電子結構分析和概念密度泛函理論系列指數分析，包括分子的親電/親核性預測，整體反應性描述符包括電離勢（IP）、電子親和勢（EA）、電負性（χ）、整體硬度（η）、化學勢（μ）、整體親電指數（ω）和整體柔軟度（S）等計算參照文獻[11-13]中定義公式。藥代動力學計算借助ACD/Labs Percepta平臺實現，該平臺基于QSAR（quantitative structure-activity relationship）模型預測化合物的藥代動力學部分參數和理化性質。所有量化計算和分析使用Guassian 16程序和Multiwfn 3.8[14]軟件完成。

2 結果和討論

2.1 構象分析 由圖1可見，在19c分子中僅有4根鍵可以旋轉產生構象，加上環構象變化，而Sut有5根鍵可以旋轉，Del中4根鍵，233中6根鍵，Lin中5根鍵，各自環的構象變化有差異。運用MMFF94力場搜索顯示，在相同的能量范圍內，19c僅有21種構象異構體，Sut有48種，Del有63種，223有69種，Lin有56種，可見19c在3aS位實現關環，從而大大減少藥效構象，在文獻[5]的系列實驗中也體現其構象限制帶來安全性和療效的提升。

2.2 幾何結構 Lin為噁唑烷酮類抗革蘭氏陽性菌藥物，同時對MDR-TB具有良好的抗菌活性，本研究的其他四種最典型化合物均以其為基礎發展而來。圖2繪制了采用M06-2X/6-311+G（2d，p）計算的該五種化合物在真空、環己烷和水環境中的幾何結構，主要鍵長依次標注在相應位置。五種化合物均有3a，4-dihydro-1H，3H-benzo[b]oxazolo[3，4-d][1，4]oxazin-1-one的立體化學結構核，是抗菌活性的中心。ZHAO等[5]發現（3S，3aS）構型是抗結核活性的最佳構型，即（3S，3aS）-3a，4-dihydro-1H，3H-benzo[b]oxazolo[3，4-d][1，4]-oxazin-1-one核，關鍵是苯基環上的R1基團和噁唑烷酮環上的R2基團的變化。在R1位引入嗎啉環等基團，在R2位取代為氨基、雜環等先后獲得86種化合物，19c（見圖2）被確定為治療MDR-/XDR-TB的一種很有潛力的分子。

三種環境計算19c結構中，C=O隨著極性增加而逐漸伸長，增加約0.01?，其余鍵長變化甚微，飽和硫嗎啉環鍵長變化僅有～0.003?。其他結構中C=O鍵長變化與19c類似。Sut是Lin的硫代類似物，其中嗎啉基氧被硫取代。MICHALSKA等[15-16]對Sut在環糊精改性非水毛細管電泳的對映選擇性識別研究中，采用B3LYP/6-31G*進行了中性態和質子化態的計算，并通過IR光譜、核磁共振和分子模擬解釋復合物形成機制。Del是一種第二代噁唑烷酮衍生物，尚在臨床試驗中。223作為另一種噁唑烷酮類藥物正在進行抗結核病的一期臨床試驗，有關Del和223的計算報道甚少，但結構顯示彼此在抗菌核心結構參數較一致。

圖2 五種化合物在真空、環己烷和水環境中M06-2X/6-311+G（2d，p）優化的主要鍵長值[單位（?）]

Lin作為第一個噁唑烷酮抗菌藥物，得到廣泛研究。實驗發現Lin固態物質可能以不同的構象形式存在，根據測定IR和熔點溫度，至少有四種構象。對比晶體構型[17]二面角參數，Lin呈第IV種構象中的a分子狀時，其ΨN3-C10、ΨC7-N2、ΨC4-C3、ΨC3-N1和ΨN1-C2值分別為-167（1）°、 -172（1）°、 -63（1）°、 -104（1）°和171（2）°，我們用M06-2X/6-311+G（2d，p）在真空計算的數值分別為-165°、-175°、-60°、-76°和172°，彼此吻合較好。a和b分子形態差異在于嗎啉環的構象具有互補性。通過計算數據分析，五種化合物核心部分整體受兩端基團變化影響不大。溶劑環境對結構影響也不明顯。

圖3 五種化合物在真空、環己烷、水和甲醇環境中M06-2X/6-311+G（2d，p）計算的IR吸收光譜

2.3 電子結構 五種化合物的前線軌道HOMO和LUMO分布分析顯示，除Del的HOMO是由三嗪環中氮2p軌道構成的π鍵，其余都由氟代苯環的π鍵構成。五種化合物LUMO軌道構成類似，其中19c和Del構成比例和相位一致，Sut、223和Lin構成類似，但占比逐漸降低，在等密度值為0.05情況下，Lin的軌道組成更加分散。五種化合物都有極性，M06-2X/6-311+G（2d，p）計算真空中極性大小是Lin（2.85μ）＜Sut（3.00μ）＜19c（3.45μ）＜223（3.77μ）＜Del 6.28μ），水溶劑環境中Lin（4.63μ）＜Sut（4.75μ）＜19c（5.17μ）＜223（5.48μ）＜Del（9.18μ），反映出化合物極性越大，在極性環境中極性改變也越大。

2.4 IR光譜 五種化合物中，Lin已應用于臨床，針對Lin的各項研究較多[18-19]。我們用M06-2X/6-311+G（2d，p）在四種環境下分別計算了五種化合物的IR振動吸收光譜（見圖3），整體而言，在真空、環己烷、甲醇和水環境中，五種化合物對應振動頻率基本呈現紅移現象，如噁唑烷酮中C=O的頻率下降約70 cm-1，酰基中的C=O則下降約55 cm-1，N-H擺動頻率受環境影響可忽略。苯環的特征峰整體紅外強度比較低。

真空中Lin的兩個羰基理論伸縮振動頻率為1 871 cm-1和1 787 cm-1，而文獻[19]測定VCD數據為1 744 cm-1和1 663 cm-1，兩者之間相較，理論計算的校正因子為0.930。MICHALSKA等[15]采用IR和NMR手段分析了Sut在環糊精β-CD中手性識別的譜學特征，并用B3LYP/6-31G*方法計算了單一Sut分子和用HF/6-31G*計算了復合體系。Sut的特征峰在噁唑烷酮的C-O鍵1 012 cm-1，噁唑烷酮的CH2對稱擺動1 416 cm-1，乙酰氨基中的C-N伸縮振動頻率1 518 cm-1，而C=O鍵在1 665 cm-1和1 745 cm-1出現。對比我們計算的Sut在甲醇中IR吸收譜，C=O鍵在1 721 cm-1和1 804 cm-1出現，而特征峰分別在1 045 cm-1、1 457 cm-1和1 560 cm-1，彼此吻合非常好。此后MICHALSKA等[16]報道了Sut合成中間體的IR和Raman數值，結合B3LYP/6-311G（d，p）計算分析，對比本研究M06-2X/6-311+G（2d，p）計算數值，基本上高5～40 cm-1。

2.5 UV-Vis光譜 五種化合物用M06-2X/6-311+G（2d，p）在真空、環己烷、水和甲醇中計算得到的UV-Vis吸收光譜曲線見圖4。五種化合物在150～320 nm范圍均有兩個吸收峰，其中遠紫外區180～200 nm和近紫外區220～320 nm理論計算各有一個吸收峰。溶劑效應對223影響最小，對Sut和Del吸收峰強度影響最為明顯，呈現遠紫外藍移近紫外紅移大約5 nm，這有待實驗驗證。紫外吸收光譜來源主要是HOMO軌道電子向LUMO+2躍遷，而Del則是HOMO軌道電子向LUMO躍遷，貢獻率達到86%。

圖4 五種化合物在真空、環己烷、水和甲醛環境中M06-2X/6-311+G（2d，p）計算的UV-Vis吸收光譜

在幾何結構分析部分，顯示Lin是IV型中的a分子態，在甲醇中近紫外最大吸收峰對應的是242.3 nm，與實驗[18]上用245.6 nm測定值接近。MICHALSKA等[16]實驗顯示Sut的R和S構型在水中時在200 nm和250 nm處有吸收峰，在甲醇中時，R和S構型可能在190 nm和260 nm處有最大吸收峰，另外溶劑環境對UV-Vis吸收光譜影響差異明顯，而我們計算溶劑模型簡單，區分不明顯，但計算的最大吸收波數比較接近。其他化合物的實驗報道甚少，化合物19c UV-Vis吸收光譜實驗數據未見報道。

圖5 五種化合物在水和甲醇中M06-2X/6-311+G（2d，p）計算的ECD譜

2.6 ECD分析 由于五種化合物中都至少有一個手性中心，而19c是兩個，分別是3S和3aS。目前計算顯示五種化合物在水中和甲醇中的ECD譜是高度吻合，見圖5。由于其整體結構差異明顯，五種化合物的ECD峰形不同，而手性微環境Sut、223和Lin比較一致。MICHALSKA等[15]在手性識別實驗中測定Sut在水和甲醇中的ECD，可能存在構型變化，結果認為圖譜不適合其實驗解釋，后來他們對Sut手性池合成中間體和終產物進行譜學分析[16]。我們用M06-2X/6-311+G（2d，p）方法結合極化連續介質模型計算甲醇中的單一構象的ECD，在CES分布上與實驗一致，波數上也十分接近。FRELEK等[19]對Lin進行ECD和VCD測定，主要是構象II和III，而我們計算比較確認是構象IV中a分子態。對ECD曲線的細致分析表明，在構象II中，在221 nm左右存在一個相對較強的負帶，并且在構象III的ECD光譜中沒有這種負帶。因此，這個帶可以被認為是區分Lin的兩種構象的診斷帶。其他三種化合物實驗測定報道較少，我們的計算有待實驗測定。

2.7 分子靜電勢分布圖 五種抗MDR-TB分子表面靜電勢如圖6所示，藍色區域表示負電荷區域，易受到親電試劑的進攻；紅色區域表示正電荷區域，易受到親核試劑的進攻；白色表示零電位區域。其中，黃球對應靜電勢極大值點，青球對應極小值點。根據圖6，我們發現靜電勢的極小值點大多位于噁唑烷酮的羰基氧、乙酰基氧和三嗪環氮附近，而極大值點大多位于氨基氫、亞甲基和端甲基氫附近。同時發現19c、Sut與Lin靜電勢分布比較接近，而Del出現6處極值點，223有5個位點。

圖6 五種化合物在真空、環己烷和水環境中M06-2X/6-311+G（2d，p）計算的靜電勢圖

2.8 全局反應性描述符 五種化合物的全局反應性參數見表1。以Lin為參考，真空中Sut的μ最低，說明其穩定性較好，19c居中；在水環境中則是19c最低。在水環境中19c、Sut和Lin的化合物整體硬度η較大且比較接近，說明它們對微干擾下化學體系電子云畸變的抵抗能力較強，分子穩定性較高；整體親電指數隨著環境極性增加而下降，化合物19c在水中ω表明其得電子能力強，反應活性較高。前線軌道能差19c與Lin比較接近，EA值均比較小或為負值，說明五種化合物整體對電子的束縛能力較弱，得電子的趨勢很小。從全局反應性描述符分析，五種分子間差距都較小，作為同類藥物具有很高的相似性，也客觀反映出Lin作為已經使用的藥物的合理性，其余在進行臨床研究的化合物，具有很大的成藥潛力。

2.9 藥代動力學評價 基礎實驗顯示具有潛在藥效的許多化合物因安全性、有效性和藥代動力學等問題而被淘汰。通過ACD/Labs Percepta軟件，可預測化合物的吸收、分布、代謝、排泄、毒性及理化性質等方面性質。如Lipinski規則是廣泛用于判定化合物類藥性是否良好的經驗規則，類藥性的篩選有利于獲得藥動學、藥效學性質平衡的候選藥。計算發現五種化合物均符合Lipinski規則，類藥性較好，化合物19c在胃（logD-pH 1.70）和血液（logD-pH 7.40）中分布系數比Lin更優。

藥代動力學性質是成藥的重要指標之一[20]，五種化合物的藥動學相關參數預測結果見表2。五種化合物均不是糖蛋白（P-gp）的底物（P-gp是一種外排轉運蛋白，表達于各種具有分泌功能的細胞上，如腸上皮細胞和腦毛細血管內皮細胞上[21]）。五種化合物對肝臟的主要代謝酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4）的抑制作用都比較弱或無抑制作用，Lin對五種代謝酶整體抑制作用最弱，19c對CYP1A2亞型，化合物19c和Sut對CYP3A4亞型稍微有抑制作用。基因毒性（Ames反應）指標顯示五種化合物可能有輕微的基因毒性。hERG指標反映五種化合物可能有輕微的心臟毒性。Caco-2（Caco-2細胞內有藥物代謝酶，Caco-2細胞模型可用于研究藥物轉運機制和預測藥物腸吸收的體外篩選[22]）結果表明Del化合物的吸收性極差，其余均相近，19c優于Lin。血漿蛋白結合率（plasma protein binding，PPB）會影響半衰期、清除率、藥物分布等藥代動力學參數[23]。19c和Sut與血漿蛋白結合強度中等，而Lin與血漿蛋白結合能力較弱。五種化合物在代謝穩定性方面比較接近。而ZHAO等[5]的系列細胞和動物實驗，19c與Sut和Lin相比均接近或更優，而體外抗結核菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）更低，體外抗耐藥結核菌比Sut和Lin的MIC要低2～10倍，hERG K+毒性在30 mmol/L以上。一項為期4周的大鼠毒理學研究顯示，19c比Lin骨髓抑制作用更小，為噁唑烷酮類的突破。化合物19c在小鼠結核病菌感染模型中體內療效優于Lin和Sut。五種化合物穿過血腦屏障都不易，在中樞神經系統（central nervous system，CNS）中的濃度低，Del在腸道吸收（human intestinal absorption，HIA）比其他四種弱。

表1 五種化合物在真空、環己烷和水環境中M06-2X/6-311+G（2d，p）計算的全局反應性描述符（eV）

表2 五種化合物的藥代動力學參數

綜上所述，本研究在M06-2X/6-311+G（2d，p）水平下，對五種MDR-TB治療藥物和潛在藥物化合物的藥效構象、幾何和電子結構、IR等系列譜學性質進行了計算分析，并結合概念密度泛函數預測整體反應指數，再利用ACD/Labs Percepta軟件預測化合物的ADME/Tox和成藥性。新化合物19c增加一個手性中心形成環狀結構大大減少藥效構象，五種化合物都是噁唑烷酮類抗結核菌化合物，在不同溶劑環境中，藥效結構幾何參數值基本一致，與晶體參數吻合較好。極性環境使Del極性改變最大，其HOMO分布與其他四種不同。該方法計算的IR光譜采用0.930校正因子后與實驗和其他計算方法吻合很好。Lin的計算最大吸收波數與實驗完全一致，除Del紫外吸收光譜是HOMO電子向LUMO躍遷為主外，其他均是HOMO向LUMO+2躍遷為主，都具有雙峰曲線。Sut計算的ECD峰與實驗相吻合。19c、Sut和Lin靜電勢分布主要集中在噁唑烷酮端，而Del和223另一端呈電勢負性。8種全局反應性描述符顯示五種化合物彼此數值接近，具有相同母核的不同衍生物，具有明顯的類藥性。類藥性評價顯示Del分布系數與其他差別大外，基本比較接近。藥代動力學參數五種化合物比較一致，但臨床用藥Lin的參數更優。