糞便腫瘤M2 型丙酮酸激酶在結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉中的診斷價值

張汗磊，王 松，陳 思，張開光

（安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230001）

結(jié)直腸腺瘤性息肉（colorectal adenomatous polyps，CAP）有一定的惡變性,其可分為管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤等類型，因無明顯臨床癥狀，較易漏診。結(jié)直腸癌（colorectalcancer）多起源于腺瘤性息肉，早期檢出腺瘤性息肉對降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率有密切的關(guān)系，CRC 約占全世界年度診斷癌癥和癌癥相關(guān)死亡的10%[1]；在我國，平均每年結(jié)直腸癌新發(fā)確診病例超過25 萬，死亡病例約14 萬，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率在各國處于中等偏上水平[2]。現(xiàn)階段我國早期結(jié)直腸癌的診斷率低于10%，明顯落后于日本和韓國[3]。因此提高我國結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉早期診斷率、降低結(jié)直腸癌相關(guān)死亡率是刻不容緩的重大臨床科學問題。免疫化學法糞便潛血試驗（immunochemical fecal occult blood test，iFOBT）是目前臨床上最常用的結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉的篩查方法。但不能檢測非出血性和不能向腸腔排出足夠血液的結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉，2003 年Hardt PD 教授第1 次在糞便中用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測出糞便腫瘤M2 型丙酮酸激酶（Tumor M2type pyruvate kinase）濃度，表現(xiàn)出了在結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉中有廣闊的應用前景[4]。目前，糞便Tu M2-PK 已被建議作為一種早期篩查結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉的新方法[5]，因為腺瘤性息肉和結(jié)直腸癌通常與糞便Tu M2-PK的升高有關(guān)，且可檢出非出血性結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉。與iFOBT 相比，無非癌性出血（痔瘡和肛裂）所導致的假陽性結(jié)果，目前國內(nèi)針對糞便Tu M2-PK 在結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉中的研究較少，本研究利用德國ScheBo○RBiotech 公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附快速試劑檢測我院結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉和正常對照組糞便中的Tu M2-PK 濃度，并進一步分析TU M2-PK 水平與結(jié)直腸癌的分期、位置和腺瘤性息肉的大小數(shù)目的關(guān)系，旨在評價其在結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉中的應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年12 月～2020 年8 月在安徽省立醫(yī)院消化內(nèi)科和胃腸外科就診的患者97 例，均經(jīng)術(shù)后病理明確診斷。結(jié)直腸癌患者50 例設(shè)為結(jié)直腸癌組，年齡31～85 歲。腺瘤性息肉患者47 例設(shè)為腺瘤性息肉組，年齡21～89 歲。同時選取結(jié)腸鏡檢查正常的31 例患者設(shè)為對照組，年齡25～81 歲，并記錄高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒史。三組比較性別、年齡、吸煙、飲酒史、糖尿病史比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），研究可行，見表1。該研究方案經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有研究對象知情同意。排除凝血功能障礙、血液系統(tǒng)疾病；有心、肝、腎、肺等臟器嚴重病變；有明顯胃腸道出血；既往有結(jié)直腸癌切除史、炎癥性腸病、其他惡性腫瘤病史。

表1 三組一般資料比較（，n）

表1 三組一般資料比較（，n）

1.2 方法 采集所有患者手術(shù)或內(nèi)鏡治療前糞便標本1 份，使用德國ScheBo○RBiotech 公司生產(chǎn)的M2型丙酮酸激酶檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）檢測糞便標本中的TuM2-PK 的濃度，往預先包被M2-型丙酮酸激酶抗體的包被微孔中，依次加入用樣本/洗滌緩沖液溶解完全的標準品、質(zhì)控品及提取完全的樣本，經(jīng)過孵育并徹底洗滌；用底物TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中的Tu M2-PK 濃度呈相關(guān)性，用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），以標準品濃度作橫坐標，對應OD 值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本Tu M2-PK 濃度；根據(jù)制造商的指示，濃度大于4 U/ml 為陽性。

1.3 觀察指標 記錄簡要病史、位置、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、侵犯深度和術(shù)后病理，進行Dukes 分期。腺瘤性息肉組記錄簡要病史、息肉大小和數(shù)目；分析Tu M2-PK 濃度與結(jié)直腸癌的分期、位置和腺瘤性息肉的數(shù)目、大小的關(guān)系，評估TU M2-PK 在結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉發(fā)展和診斷中的作用。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（）表示，采用方差分析分析，計數(shù)資料以（n）和（%）表示，采用χ2檢驗，不同分類水平非參數(shù)分布資料比較采用多個樣本秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.001 表示統(tǒng)計學意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 三組糞便Tu M2-PK 濃度和陽性率比較 結(jié)直腸癌組、腺瘤性息肉組、正常對照組Tu M2-PK 濃度分別為0.18～99.50、0-68.90、0-8.40 U/ml。參考既往研究以濃度大于4 U/ml 為診斷結(jié)直腸癌的cut-off值，三組糞便Tu M2-PK 濃度和陽性率比較，統(tǒng)計學意義顯著（P＜0.001）；結(jié)直腸癌組TU M2-PK 的濃度和陽性率高于腺瘤性息肉組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組糞便Tu M2-PK 濃度和陽性率比較[，n（%）]

表2 三組糞便Tu M2-PK 濃度和陽性率比較[，n（%）]

2.2 ROC 曲線確定糞便TU M2-PK 在腺瘤性息肉組的診斷價值 用ROC 曲線確定Tu M2-PK 在腺瘤性息肉中診斷的最佳截斷值為2.62 U/ml，在此截斷值下敏感度為51.06%，特異度為80.65%，約登指數(shù)為0.317。ROC 曲線下面積為0.704（95%CI：0.588～0.819），見圖1。

圖1 糞便TU M2-PK 在腺瘤性息肉組診斷價值的ROC 曲線

2.3 糞便TU M2-PK 水平與結(jié)直腸癌的分期、位置、腺瘤性息肉大小和數(shù)目的關(guān)系 參考既往研究以濃度大于4 U/ml 為診斷結(jié)直腸癌的cut-off 值，在結(jié)直腸癌組不同腫瘤的分期糞便Tu M2-PK 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同位置糞便Tu M2-PK 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；結(jié)腸和直腸均患有腫瘤的患者為3 例，其中2 例糞便TU M2-PK 為陽性；以ROC 曲線確定2.62 U/ml 為診斷腺瘤性息肉的最佳截斷值，在腺瘤性息肉組中糞便Tu M2-PK 的水平與息肉的大小和數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 糞便Tu M2-PK 水平與結(jié)直腸癌的分期、位置、腺瘤性息肉大小和數(shù)目的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤，該病起病隱匿、病情發(fā)展迅速、死亡率高、疾病負擔重，大多數(shù)起源于先前存在的腺瘤性息肉，通過篩查無癥狀的中等風險個體，可以檢測到可治愈的癌癥和可切除的腺瘤性息肉，達到疾病的自然病程中斷或治愈機會增加的目的。目前，結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉的早期診斷主要依賴于結(jié)腸鏡檢查，但結(jié)腸鏡檢查是一種有創(chuàng)性檢查，因此限制了其廣泛使用；糞便潛血試驗是目前臨床上最常用的結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉的篩查方法。iFOBT 在無癥狀、平均風險人群中檢出結(jié)直腸癌的敏感性約在79%左右[6]。檢出腺瘤性息肉的敏感性較低，一般僅20%～30%，即使在高危人群中也不足50%[7]。本研究的M2 型丙酮酸激酶是糖酵解過程中丙酮酸激酶的同分異構(gòu)體，主要以四聚體和二聚體的形式存在，并可進行相互轉(zhuǎn)化，在腫瘤細胞中這種二聚體和四聚體M2-PK 的比例會受腫瘤蛋白和能量代謝介質(zhì)的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生變化，以適應腫瘤代謝的需要，且主要以二聚體形式存在，并被稱為腫瘤M2 型丙酮酸激酶[8]。可以被分泌到腸道中來進行胃腸道腫瘤和腺瘤性息肉的診斷[4]。Leen R 等[9]證實在腸道篩查中Tu M2-PK 較iFOBT 檢出腺瘤性息肉更加敏感，Kim YC[10]等既往的研究表明糞便Tu M2-PK 在結(jié)直腸癌篩查方面的敏感性在80%左右，可檢出非出血性結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉，且國內(nèi)關(guān)于這方面的研究較少。

本研究Tu M2-PK 的濃度在結(jié)直腸癌中高于腺瘤性息肉組和正常對照組，結(jié)合既往研究以4 U/ml為截斷值[11]，本研究在診斷結(jié)直腸癌的敏感性方面高于腺瘤性息肉（82.00% vs 46.80%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且與結(jié)直腸癌的分期有關(guān)，與Bond AD 等[12]的研究結(jié)果一致，這表明隨著病理腺瘤-癌途徑的發(fā)展，糞便Tu M2-PK 的陽性率和濃度逐漸增加，體現(xiàn)了Tu M2-PK 在結(jié)直腸癌診斷中的潛在用途，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究中結(jié)腸和直腸均患有腫瘤的患者為3 例，其中2 例糞便TU M2-PK 為陽性，進行結(jié)腸癌和直腸癌兩者之間的糞便Tu M2-PK 水平統(tǒng)計學分析，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能表明糞便Tu M2-PK 水平與結(jié)直腸癌的位置無關(guān)。在腸道中穩(wěn)定存在，不隨腸道的蠕動而發(fā)生分解。這表明其用于結(jié)直腸癌的診斷和篩查中的穩(wěn)定性。

本研究結(jié)果顯示，采用ROC 曲線確定糞便Tu M2-PK 診斷腺瘤性息肉的最佳截斷值為2.62 U/ml，較診斷結(jié)直腸癌的截斷值降低，這可能與本文的樣本量較少有關(guān)，在此截斷值下敏感度為51.06%，特異度為80.65%，約登指數(shù)為0.317。ROC 曲線下面積為0.704（95%CI：0.588～0.819），對腺瘤性息肉無特異性診斷價值，能否用于大規(guī)模腺瘤性息肉的篩查來降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率有待進一步前瞻性試驗的研究。本研究進一步分析糞便Tu M2-PK 水平在腺瘤性息肉組中與息肉大小和數(shù)目之間的關(guān)系，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這與Keenan J 等[13]研究一致，這表明糞便Tu M2-PK 水平與息肉大小和數(shù)目無關(guān)，從側(cè)面證實了糞便Tu M2-PK 水平與病理結(jié)果有關(guān)，而與病灶的大小和數(shù)目無關(guān)，體現(xiàn)了Tu M2-PK 可能與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

本文的不足是未在分子基礎(chǔ)上對Tu M2-PK 在病理腺瘤-癌的發(fā)生、發(fā)展過程中做進一步研究，且未對高危人群進行前暫性臨床試驗的研究，能否用于結(jié)直腸癌和腺瘤性息肉的篩查有待進一步驗證，且本文樣本量較小，有待在以后的臨床工作中繼續(xù)擴大樣本量進行前瞻性臨床試驗的研究。

綜上所述，Tu M2-PK 在腸道中穩(wěn)定存在，是一種良好的腫瘤篩查標志物，對腺瘤性息肉的診斷價值不高，在結(jié)直腸癌糞便中濃度高于腺瘤性息肉，并與腫瘤的分期有關(guān)，隨著病理腺瘤-癌途徑的發(fā)展，糞便Tu M2-PK 濃度越來越高，可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。