長鏈非編碼RNA MIAT 在2 型糖尿病外周血單核細胞中的表達及相關性分析

耿 佳，劉 芬，曹 瑩，3，邢 遠，3，王雪梅，，3

（1.西安醫學院公共衛生學院衛生學教研室，陜西 西安 710021；2.新疆醫科大學第一附屬醫院動物疾病模型研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；3.陜西省公共安全醫學防控研究中心，陜西 西安 710021）

據估計，全世界年齡在20～79 歲人群中，有4.15 億是糖尿病患者，每年約有500 萬人死于糖尿病及其并發癥，糖尿病相關疾病的醫療費用估計為6730 億美元。此外，截止2025 年，糖尿病患者將增至5.6 億，約占全球人口的7%。現階段臨床上主要通過綜合治療控制血糖，但是大多數2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者的血糖控制并不理想，易造成心、腦、腎等系統出現并發癥，疾病預后較差，病死率較高[1]。當前醫學認知認為T2DM 是由于多種遺傳易感因素、環境和行為因素的相互作用所導致的，各種因素如何發揮作用有待進一步闡明[2]?？崭寡獫{葡萄糖（fasting blood-glucose，FBS）和口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）是糖尿病診斷的“金標準”[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA。研究表明[4]，lncRNA在劑量補償效應、表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發揮重要作用，作為遺傳易感因素，從基因水平轉錄調節或轉錄后調節能量代謝，成為遺傳學研究熱點。同時，人體2 型糖尿病相關的許多單核苷酸多態性位點都是坐落在lncRNA 區域內，其中長鏈非編碼RNA 心肌梗死相關轉錄本（myocardial infarction-associated transcript，MIAT）在急性心梗和T2DM 及其并發癥中的表達都存在顯著差異[5]。不同于mRNA，lncRNA 作為生物標志物有自身的優勢，其本身就是功能分子，其的表達水平能更好地反映疾病狀態，其表達模式高度特異，提示其表達狀態可以被用于某些疾病的精細分期或分類。因此，本研究從基因水平分析lncRNA MIAT 與臨床指標之間的聯系，作為T2DM診斷標志物的價值及參與調控T2DM 的機制，為T2DM 的尋找新的生物診斷和治療靶點，提供有價值的理論基礎和實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年8 月～2018 年2 月在新疆醫科大學第一臨床附屬醫院入院進行就診的100例漢族T2DM 患者作為T2DM 組。納入標準：依據2013 年中國糖尿病防治指南公布的2 型糖尿病診斷標準：空腹血漿葡萄糖≥7.0 mmol/L 或口服糖耐量實驗（OGTT）后2h 血糖≥11.1 mmol/L 或既往有確切糖尿病病史、正在使用降糖藥物或胰島素者。排除標準：①其他特殊類型糖尿病；②惡性腫瘤；③慢性炎癥等相關疾??；④嚴重的心肝肺腎等疾??；⑤自身免疫性疾病。選擇同期在該院進行就診的漢族非T2DM 患者作為對照組，共100 例。納入標準：空腹血漿葡萄糖＜6.1 mmol/L 和OGTT 后2h 血糖＜7.8 mmol/L。排除標準：①既往診斷為2 型糖尿??；②合并其他內分泌疾病；③惡性腫瘤；④急、慢性感染及嚴重傳染性疾病患者；⑤嚴重的心肝肺腎等疾病；⑥自身免疫性疾病。所有研究對象均為無血緣關系并且在新疆地區長久居住的常住人口，排除了環境差異而引起的基因變異。本研究方案經新疆醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，研究對象均自愿簽署書面知情同意書。

1.2 血生化指標的測定 采集兩組清晨空腹抽取靜脈血5 ml，全血樣本在室溫下保存30 min，以使血液凝固。樣品在4 ℃下3000 r/min 離心10 min 分離血清，用全自動生化分析儀應用標準試劑盒檢測包括FPG、餐后2h 血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血尿酸、肌酐、尿素等生化指標。生化指標均由新疆醫科大學第一附屬醫院檢驗中心統一測定。

1.3 外周血RNA 提取和反轉錄 將3～5 ml 肝素抗凝全血樣品以3500 r/min 離心10 min，用淋巴細胞分離液（Solarbio，中國）分離單核細胞，將分離出來的單核細胞用4 ℃預冷的D-Hanks 緩沖液沖洗2次，離心沉淀后加入l ml 細胞裂解液（Trizol，Invitrogen，USA），置于冰上反復輕輕吹打細胞至混勻。常規方法提取細胞總RNA，按照試劑說明將RNA 逆轉錄合成cDNA（Thermo，USA）。

1.4 實時熒光定量PCR 法檢測lncRNA 的表達 檢測 lncRNA MIAT 的編號、lncRNA 的位置和擴增引物見表1。按照SYBR GREEN 試劑盒（Applied Biosystems，USA）說明書，應用實時熒光定量PCR 儀（500 HT Fast real-time PCR system，BIO-RAD，USA）進行實時熒光定量反應測定相關RNA 分子的表達。

表1 選取的T2DM 相關lncRNAs 分子的位置和實時熒光定量反應的引物序列

1.5 統計學方法 采用IBM SPSS 22.0 統計軟件進行統計分析。計量資料用（）表示，計數資料用（n）和（%）表示，做χ2檢驗。連續型變量的比較采用獨立樣本t檢驗。采用實時熒光定量PCR 的數據分析采用2-△△CT法，△CT=目的基因CT 值-內參基因CT 值，△△CT=T2DM 組△CT 值－對照組△CT 值。相關性檢驗采用Spearman 法檢測，ROC 曲線法分析其作為診斷標志物的價值。多變量Logistic 回歸分析MIAT 與T2DM 的關系，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、體重指數、舒張壓、尿素、肌酐和尿酸比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；兩組高血壓、收縮壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、空腹血糖和餐后2 h 血糖比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組一般資料比較[，n（%）]

表2 兩組一般資料比較[，n（%）]

注：a 代表連續型變量的比較采用獨立樣本t 檢驗，b 代表計數資料用χ2 檢驗

2.2 外周血中lncRNA MIAT 的表達 通過檢測lncRNA MIAT 在T2DM 組和對照組的表達發現，在糖尿病患者的外周血中MIAT 的表達顯著升高，差異表達倍數是（1.90±0.85）vs（1.11±0.66）（P=0.004）。

2.3 評價MIAT 作T2DM 生物標志物的價值 通過ROC 曲線分析，MIAT 的AUC 為0.753（95%CI=0.689～0.817）見圖1，MIAT的最佳臨界點的是0.950，相應的靈敏度是0.970，特異度是0.470，95%CI=0.686～0.820。進行多變量Logistic 回歸分析，進一步驗證MIAT 是T2DM 的危險因素 [OR=1.527，95%CI=1.130～1.919]，見表3。進一步檢測了lncRNA MIAT 表達與糖尿病危險因素、血糖水平指標之間的相關性。Spearman 相關性分析結果表明，lncRNA MIAT 的變化與高血壓、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、糖耐量呈正相關（P＜0.05），見表4。

圖1 lncRNA MIAT 的曲線下面積

表3 多元回歸分析糖尿病患病危險因素

表4 糖尿病人外周血單核細胞中MIAT 的表達和糖尿病風險因素、血糖參數的相關性

表4（續）

3 討論

T2DM 是一組以血糖濃度升高為特征的代謝紊亂[6]。本研究中T2DM 組lncRNA MIAT 對照組表達較增加（P＜0.05），表明lncRNA MIAT 對于T2DM 有一定的診斷價值。近年來，lncRNA 作為T2DM 的生物標志物和新的干預治療靶點研究是新的追蹤熱點[7，8]。lncRNA 生物標志物在循環水平上較傳統的蛋白質生物標志物更穩定，檢測靈敏度更高[9，10]?？捎胵RT-PCR檢測RNA 的微量表達，作為疾病診斷的輔助指標[11]。

心肌梗死相關轉錄本lncRNA MIAT 位于人22號染色體上，是T2DM 的敏感部位，MIAT 水平與T2DM 呈正相關[9]。高糖血癥能夠導致內皮細胞MIAT表達水平增加，STZ 誘導的糖尿病小鼠模型中MIAT和NF-κBp-p65 表達增加[12]。體外實驗顯示MIAT 敲除能夠緩解糖尿病誘導的視網膜的新血管形成，血管滲漏和炎癥[13]。本研究與既往研究結果一致，MIAT與糖尿病發病呈正相關，且進一步探討了其相關性和診斷價值。通常根據ROC 中的AUC 數值、特異性和敏感性數值來判斷檢測指標是否具有診斷價值，盡管研究中MIAT 的AUC 值是0.753，但也是具有巨大潛力和價值的診斷標志物（0.7～0.8 良好；0.6～0.7有效）[14，15]。糖尿病患者外周血單核細胞中MIAT 的表達和低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯、血糖參數與MIAT 的表達呈正相關，且具有顯著差異性，提示MIAT 的表達和脂質代謝與血糖水平密切相關。

綜上所述，在疾病的病理發生中lncRNA 分子發揮著重要的作用，探討其在疾病病理發生中的調節作用機制，對于疾病的干預和治療有著重要的意義。對lncRNAs 的進一步研究將促進心血管疾病發病機制的認識。在這項實驗研究中，探討了MIAT 在全血樣本的外周血單核細胞的表達，還未檢測血清中MIAT 的表達，兩者表達和作用途徑是否相同有待進一步探明。PBMCS 中的lncRNA MIAT 可能是診斷AMI 的有效生物標志物，探討其調控機制可能成為T2DM 治療的一個潛在應用方向。