三葉青總黃酮影響心肌細胞的活性及DJ-1表達

郭永梅

（江西醫學高等專科學校藥學院，江西 上饒 334000）

心肌缺氧/復氧（Hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型是一種缺血性心肌病及心臟手術后出現心衰的常見損傷模型[1]。近年來，研究表明，許多中藥的活性成分可以適當地減少心肌H/R損傷[2]。三葉青是我國家特有的藥用植物，具有清熱解毒祛腫等功效[3]。迄今為止，關于三葉青總黃酮對心肌H/R損傷的保護作用鮮見報道。本研究三葉青總黃酮對H9C2細胞H/R損傷的保護作用。

1 材料與儀器

1.1 細胞株

H9C2細胞（中科院上海細胞庫）。

1.2 藥物與試劑

三葉青（懷玉山）；高糖DMEM培養基（碧云天）；胎牛血清（四季青）。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1F超凈工作臺（安泰技術有限公司）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）；IX71倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯）。

2 方法

2.1 細胞的培養

細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中于37℃，5%CO2下培養，當細胞融合度達85%左右時傳代，每3天傳代1次，取對數生長期細胞接種，以便進行后續實驗。

2.2 三葉青總黃酮對H9C2細胞的活性實驗

將高糖的DMEM（含10%胎牛血清）來培養大鼠源永生化H9C2細胞，制成5×104mL的細胞懸液，按100μL/孔接種在96孔板，于37℃二氧化碳培養箱（含5% CO2）中孵育24 h，吸棄原培養液，分別用3、6、9、18、36、72μg·mL-1等濃度的三葉青總黃酮處理24 h。結束前4 h加入1.9 mg·mL-1的MTT液20μL，再繼續培養4 h，用到酶標儀于490 nm波長進行檢測光的密度D（λ）值。

2.3 H9C2細胞H/R模型的建立

按2.2項處理，用DMEM培養液配制氯化鈷的溶液，濃度在600～1 600μmol·L-1之間，分別于6 h、12 h、18 h、24 h確定氯化鈷的濃度及缺氧的時間。估約最佳的復氧時間，缺氧的時間完成后，摒棄那些缺氧的液體，用高糖的DMEM培養液（含10%胎牛血清）分別進行復氧1 h、2 h、3 h、6 h。

2.4 藥物處理

實驗為正常的組，H/R的模型的組和三葉青總黃酮低的（3μg·mL-1）、中的（6μg·mL-1）、高的（9μg·mL-1）濃度預處理的組。

2.5 指標檢測

按試劑盒檢測SOD、LDH、MTT及Westen blot測定DJ-1蛋白表達。

2.6 統計學處理

用SPSS17.0分析，計量用mean±sd表示，方差分析比較組與組之間的差別。

3 結果

3.1 三葉青總黃酮對H9C2細胞成活率的影響

結果如圖1所示，當藥物的濃度達到了9μg·mL-1時，H9C2細胞的成活率顯著高于空白對照組，但是隨著藥物的濃度的逐漸提高，H9C2細胞的成活率則逐漸地降低，故而以三葉青總黃酮9μg·mL-1為最高地濃度，依次設定低、中、高濃度分別為3、6、9μg·mL-1。

圖1 三葉青總葉黃酮對H9C2細胞成活率的影響

3.2 H9C2細胞H/R模型的建立

當氯化鈷地濃度為1 200μmol·L-1，缺氧地時間為18 h，復氧地時間就為2 h是本實驗細胞H/R損傷模型的最佳地條件。

3.3 三葉青總黃酮對H/R損傷大鼠源永生化H9C2心肌細胞成活率的影響

結果如圖2所顯示，與模型地組相對比，三葉青總黃酮6、9μg·mL-1組細胞成活率顯著升高（P＜0.05）。

3.4 三葉青總黃酮對H/R損傷H9C2細胞上清液中LDH及細胞內SOD水平的影響

比較正常對照地組，模型地組的上清液中的LDH及細胞內MDA水平明顯提高，細胞內SOD活性明顯下降（P＜0.05）。

3.5 三葉青總黃酮對H/R損傷H9C2心肌細胞DJ-1蛋白表達的影響

結果如圖3所示，比較正常對照的組，模型的組的DJ-1蛋白表達明顯升高（P＜0.01）。比較模型的組，三葉青總黃酮中劑量的組、高劑量的組DJ-1蛋白表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 不同復氧時間對H9C2細胞成活率的影響

圖3 三葉青總黃酮對H/R損傷H9C2心肌細胞DJ-1蛋白表達的影響（*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較）

4 結語

實驗的結果顯示，經三葉青總黃酮的處理后，細胞內的MDA含量下降，而SOD的活性增加，由此可以看出，三葉青總黃酮能降低細胞的H/R的損傷。