石菖蒲核心代謝效應物α-細辛醇對癲癇幼鼠海馬區神經元形態及星形膠質細胞活化的影響

趙明明，許文青，陶凱歌，劉宇杰，劉美英，姚瑞芹

徐州醫科大學，江蘇徐州 221004

癲癇是以反復癇性發作為特征的慢性神經系統疾病，全球癲癇患者年增長240萬左右，其中兒童期患者最多，患病率為0.4%～0.9%［1-2］。近年來，中藥在治療癲癇方面由于其低不良反應和顯著療效，引起醫藥界重視［3］。石菖蒲是臨床上廣泛用于治療癲癇的一種中藥材，本課題組前期研究發現α-細辛醇是石菖蒲的核心代謝效應物，并設計合成了α-細辛醇及其衍生物，已獲得國家專利。司替戊醇是一種臨床上用于難治性兒童癲癇Dravet綜合征治療的“孤兒藥”，其可通過抑制神經細胞內乳酸脫氫酶（LDH）的活性來控制癲癇發作［4］。課題組前期研究發現，α-細辛醇可顯著抑制LDH活性，且同摩爾劑量下優于陽性藥司替戊醇［5-6］。2019年7月—2020年7月，我們觀察了α-細辛醇對癲癇幼鼠海馬區神經元形態及星形膠質細胞活化標志物膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 健康清潔級新生11 d的SD大鼠30只，體質量21～29 g，由徐州醫科大學動物實驗研究中心提供，生產許可證號SCXK（魯）2014007。主要試劑：α-細辛醇（西北大學），氯化鋰、匹魯卡品（美國Sigma公司），阿托品（上海陶素生化科技有限公司），兔抗GFAP一抗（Protenintech公司），山羊抗兔熒光二抗（美國Abcam公司）。主要儀器：正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），Odyssey激光成像系統（美國LI-COR公司）。

1.2 動物分組與模型建立 將30只大鼠隨機分為正常組、模型組、溶劑對照組、陽性對照組和α-細辛醇組，每組6只，雌雄不拘。正常組不處理，其余各組制備癲癇模型。造模方法：腹腔注射氯化鋰（125 mg/kg），18～20 h后 腹 腔注 射 匹 魯卡 品（30 mg/kg）誘導癲癇發作。根據Racine相關標準對造模進行分級［7］，將Ⅳ級及以上癲癇發作定義為造模成功。如未達到造模成功標準，則每30 min重復腹腔注射匹魯卡品10 mg/kg，重復3次及以上者剔除，本研究均注射一次造模成功。造模成功后持續觀察幼鼠40 min，注射阿托品1 mg/kg，10 min后按體質量200 mg/kg注射水合氯醛終止癲癇發作。

1.3 藥物干預 溶劑對照組、陽性對照組和α-細辛醇組分別在給予匹魯卡品前15 min腹腔注射50 mg/kg Tween80、司替戊醇和α-細辛醇，正常組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水。每日給藥3次，連續7 d。

1.4 幼鼠海馬組織標本獲取 每組取3只幼鼠在給藥7 d后全麻，仰臥位固定，剪開胸腔充分暴露心臟；將灌注針插入心尖部，剪破右心耳后灌注。快速灌注生理鹽水溶液，直至肝臟逐漸變為白色、右心耳流出清亮液體；以4%多聚甲醛固定液灌注血管，待幼鼠抽動停止、全身組織和器官僵硬后停止灌注。斷頭取腦，放入4%多聚甲醛中固定12～24 h。固定后的腦組織先后經15%、30%蔗糖溶液脫水，待大腦完全沉入30%蔗糖后取出。在冰凍切片機內用OCT將腦組織進行包埋，并進行海馬組織連續冠狀切片，切片厚度約30μm，用于尼氏染色、免疫熒光染色。各組剩余幼鼠在全麻下冰上快速斷頭處死，取海馬部位腦組織并稱重，放入-80℃冰箱備用，用于Western blotting檢測。

1.5 幼鼠海馬組織神經元形態觀察 采用尼氏染色法。各組取切片5張，經二甲苯及梯度乙醇處理，蒸餾水沖洗后置于1%甲苯胺藍染液中浸染30 min。蒸餾水沖洗后于95%乙醇中分化2～3 min，使用無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察并攝片。

1.6 幼鼠海馬組織GFAP蛋白檢測 ①免疫熒光染色：各組取5張與尼氏染色相鄰的切片，0.01 mol/L PBS沖洗、晾干后，加封閉液37℃封閉40 min；切片晾干，滴加一抗，室溫放置30 min，4℃過夜。取出切片，復溫、沖洗、晾干后，避光滴加熒光二抗，室溫孵育2 h；沖洗后滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染劑室溫放置5 min，用PBS沖洗、晾干。加甘油緩沖液封片，在顯微鏡下觀察GFAP蛋白陽性顆粒（紅色熒光）的表達情況并攝片。采用Image J軟件分析圖像積分光密度（IOD）值并計算平均光密度（MOD）。MOD=IOD/圖片總面積（AREA）。MOD值越高，表示GFAP表達越高。②Western blotting：每50 mg腦組織加入200μL蛋白裂解液和2μL蛋白酶抑制劑，充分勻漿后4℃離心機離心，取上清層分裝。按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，并按最低濃度配平各組蛋白濃度。上清內加入相應量的蛋白上樣緩沖液，沸水浴15 min后分裝備用。配置10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后經凝膠電泳分離，電轉移至NC膜上。轉移后用5%脫脂奶粉封閉，然后滴加GFAP一抗（稀釋比例1∶5 000）孵育，4℃過夜。洗膜后，滴加熒光標記的山羊抗兔抗體（稀釋比例1∶5 000），37℃反應2 h。洗膜3次后用Odyssey激光成像系統掃描圖像，用Image J軟件對結果進行分析。以β-actin為內參，計算GFAP蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以-x±s表示，組間比較行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組海馬組織神經元形態比較 正常組海馬CA1和CA3區可見大量致密的錐體細胞，神經元排列整齊，形態完整，染色質分布均勻；尼氏染色均勻、無凝集、無分散。造模7 d后的模型組與溶劑對照組海馬CA1和CA3區尼氏染色減弱，部分神經元細胞形態不完整，細胞腫脹或皺縮，輪廓模糊，界限不清；細胞間距增加，排列疏松紊亂。與模型組相比，陽性對照組和α-細辛醇組海馬CA1和CA3區多數錐體細胞邊緣清晰，形態基本正常，神經元排列整齊呈條帶狀，尼氏染色較均勻。見OSID碼圖1。

2.2 各組海馬組織GFAP蛋白表達比較

2.2.1 各組海馬組織免疫熒光染色結果比較 海馬CA1和CA3區GFAP蛋白陽性顆粒及MOD值模型組、溶劑對照組＞陽性對照組、α-細辛醇組＞正常組（P均＜0.05）；模型組與溶劑對照組、陽性對照組與α-細辛醇組GFAP MOD值差異無統計學意義。見表1、OSID碼圖2。

表1 各組幼鼠GFAP蛋白MOD值比較（-x±s）

2.2.2 各組海馬組織Western blotting檢測結果比較 正常組、模型組、溶劑對照組、陽性對照組、α-細辛醇組GFAP蛋白相對表達量分別為0.59±0.02、0.88±0.05、0.91±0.05、0.60±0.05、0.59±0.04；模型組、溶劑對照組＞陽性對照組、α-細辛醇組＞正常組（P均＜0.05），模型組與溶劑對照組、陽性對照組與α-細辛醇組GFAP蛋白相對表達量比較差異無統計學意義。見OSID碼圖3。

3 討論

癲癇是兒童多發的腦神經失調性疾病，藥物治療仍為目前癲癇的主要治療方法。臨床上廣泛運用的西醫抗癲癇藥（AEDs）有菲爾氨酯、拉莫三嗪、司替戊醇、普瑞巴林等，而這些藥物僅能起到60%～80%的療效，始終無法根治癲癇，依然有30%～40%的患者會惡化成難治性癲癇［8］。長期服用AEDs還可能出現諸多不良反應，如惡心、頭痛、失調、神經性厭食、肝損傷、腸功能紊亂、困倦等。目前，藥物的不良反應以及患者對藥物產生的耐藥性已成為現有AEDs治療失敗的主要原因［9］。Dravet綜合征是一種比較復雜且難以根治的疾病，屬于難治性兒童癲癇。因此，開發多（新）靶點、低毒性、低不良反應且適于兒童服用的藥物兼具緊迫性與挑戰性［10］。

中藥治療癲癇早在《黃帝內經》中就有記載，中醫基礎理論認為癲癇屬于癇病范疇。隨著研究的不斷深入，中藥在治療癲癇方面由于其療效顯著、不良反應小，逐漸被臨床廣泛應用。迄今為止，2015版《中國藥典》共收錄14種抗癲癇中藥復方及制劑。本課題組前期研究發現，α-細辛醇作為“遠志－石菖蒲”藥對及化學藥“α-細辛腦膠囊”的核心代謝效應物，與現有AEDs的結構顯著不同，是一種全新的抗癲癇活性分子骨架；其對多種類型的動物癲癇模型有較好抗癲癇活性、較低神經毒性，具有良好的開發優勢，值得繼續深入研究［11］。

神經元丟失和膠質細胞活化增殖是癲癇的特征性病理改變，而在各種膠質細胞中星形膠質細胞占50%～60%。星形膠質細胞不僅能回收和釋放神經遞質，緩沖細胞外鉀離子，參與血腦屏障和突觸的形成，還參與神經傳遞和代謝調節，為神經元提供穩定的微環境［12］。越來越多的研究表明，星形膠質細胞在癲癇發生與發展過程中扮演了重要角色，星形膠質細胞的激活或增殖會導致細胞內外神經遞質、代謝酶、離子濃度等變化，進而參與癲癇的發病過程［13-16］。因此，通過干預功能失調的星形膠質細胞可能是治療癲癇新的潛在治療策略。

本研究以SD大鼠幼鼠為研究對象，利用氯化鋰—匹魯卡品制備幼鼠癲癇模型，用石菖蒲核心代謝物α-細辛醇連續給藥7 d，觀察海馬區神經元形態及星形膠質細胞活化的變化。結果顯示，α-細辛醇對癲癇幼鼠海馬區神經元細胞的形態改變和星形膠質細胞活化有抑制作用。這提示α-細辛醇能夠減緩氯化鋰—匹魯卡品誘導癲癇幼鼠海馬區神經元損傷并抑制星形膠質細胞活化，從而抑制癲癇的發生發展。本實驗為α-細辛醇作為一種新的抗難治性癲癇藥物的開發提供了實驗依據，但其具體抗癲癇作用的機制以及神經毒性還需要進一步研究。