超聲彈性成像參數(shù)與血漿miR-663、miR-221診斷乳頭狀甲狀腺癌的價(jià)值及其病理學(xué)基礎(chǔ)分析

陳沛芬，賴瑾瑜，陳俊君

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院，廣東東莞 523059

流行病學(xué)調(diào)查顯示，乳頭狀甲狀腺癌（PTC）發(fā)病率約占甲狀腺癌的80%，10年生存率＞90%［1］；但部分患者腫瘤侵襲性強(qiáng)，易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病死率增加。既往臨床篩查及早期診斷PTC較為有效方法為細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢，但仍存在一些假陰性及難確診病例，診斷特異度不甚理想。因此，探尋一種合理有效的早期診斷預(yù)警手段是當(dāng)前PTC的研究重點(diǎn)。超聲彈性成像技術(shù)可有效反映組織形變能力，客觀、真實(shí)且量化反映病灶與附近組織彈性硬度差別，從而為甲狀腺病變定性提供一定診斷依據(jù)［2］。大量研究表明，微小RNA（miRNA）會(huì)破壞癌基因與抑癌基因的平衡從而參與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展［3］，客觀反映惡性腫瘤的侵襲程度［4］。2019年6月—12月，我們分析了超聲彈性成像參數(shù)聯(lián)合miR-663、miR-221診斷PTC的價(jià)值，并通過分析其與PTC組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)的關(guān)系，以探討其可能的病理學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)東莞市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取我院同期收治的PTC及甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①PTC符合《甲狀腺微小乳頭狀癌診斷與治療專家共識(shí)（2016版）》［5］的診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)病理證實(shí)，甲狀腺良性結(jié)節(jié)經(jīng)病理診斷確診為良性結(jié)節(jié)；②臨床資料均完整；③患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有甲狀腺手術(shù)史；②合并頸部局部或全身感染性疾病；③近期有免疫調(diào)節(jié)劑、激素類藥物服用史或腫瘤治療史；④合并肝腎功能異常或血液系統(tǒng)疾病；⑤合并甲狀腺彌漫性病變、橋本甲狀腺炎或甲狀腺功能亢進(jìn)；⑥精神行為異常。共收集甲狀腺疾病患者352例，其中患者PTC（惡性組）、甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者（良性組）各176例。惡性組中男69例、女107例，年齡（47.75±2.96）歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期70例、Ⅲ～Ⅳ期106例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移96例；良性組中男72例、女104例，年齡（48.11±3.15）歲。兩組年齡、性別具有可比性。

1.2 超聲彈性成像參數(shù)獲取 采用MyLab 90彩色多普勒超聲診斷儀，選取LA523探頭，頻率5～13MHz。患者取仰臥位，顯露頸部。先實(shí)施二維灰階超聲檢查，確認(rèn)結(jié)節(jié)位置與大小。后切換至彈性成像檢查，以結(jié)節(jié)為中心選取感興趣區(qū)（ROI），主要囊括結(jié)節(jié)及周圍正常組織；探頭與皮膚呈垂直狀態(tài)，手持探頭，輕微震動(dòng)，頻率為2～4次/秒；待“彈簧”圖標(biāo)呈綠色，繼續(xù)穩(wěn)持3～4 s；反復(fù)實(shí)施3次，取得良好彈性成像圖像。由2位具備＞5年經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師進(jìn)行圖像分析，定量參數(shù)取平均值。彈性比值：在彈性成像圖像上手動(dòng)圈定ROI（盡量包含全部病灶）及對照區(qū)域，兩者深度盡量在同一平面且面積基本相似，軟件自動(dòng)獲取彈性圖像ROI與對照區(qū)比較所得彈性比值。藍(lán)色面積比值：沿結(jié)節(jié)及其內(nèi)藍(lán)色區(qū)域邊緣對輪廓進(jìn)行勾畫，軟件分析計(jì)算藍(lán)色面積所占ROI的比值。

1.3 血漿miR-663、miR-221檢測 采集靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中；以3 000 r/min離心10 min，分離血漿后再以12 000 r/min離心10 min，取上清置于微量離心管（不含RNA酶）中，-80℃低溫保存待檢。采用qRT-PCR法檢測血漿miR-663、miR-221，按試劑盒說明書操作，相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.4 甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)檢測 留取組織標(biāo)本，添加TRIzol試劑、氯仿裂解細(xì)胞；4℃下以12 000 r/min離心15 min，取無色液相層；添加等體積異丙醇，沉淀RNA生成膠塊。以75%乙醇對RNA沉淀進(jìn)行清洗，室溫干燥后采用紫外光吸收法檢測總RNA純度；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成樣品cDNA，用RT-PCR試劑盒實(shí)施增殖基因（Twist1、TPX2）、侵襲基因（CXCR4、ADAM9）、自噬基因（Beclin1、LC3）mRNA擴(kuò)增，獲取反應(yīng)后PCR擴(kuò)增曲線，計(jì)算目標(biāo)基因mRNA表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)；各指標(biāo)診斷PTC的價(jià)值采用受試者工作特征（ROC）曲線分析，各指標(biāo)與PTC組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)的關(guān)系行Pearson線性相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較 惡性組藍(lán)色面積比值、彈性比值及血漿miR-221水平高于良性組，而血漿miR-663水平低于良性組（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較（±s）

表1 兩組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較（±s）

注：與良性組比較，*P＜0.05。

組別惡性組良性組n 176 176藍(lán)色面積比值（%）45.36±15.48*33.82±13.65彈性比值1.76±0.59*1.31±0.38血漿miR-663 2.52±1.04*3.97±1.25血漿miR-221 0.87±0.14*0.32±0.07

2.2 惡性組不同臨床病理特征患者超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較 惡性組臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者藍(lán)色面積比值、彈性比值、血漿miR-221水平高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，血漿miR-663水平低于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P均＜0.05）。見表2。

2.3 超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221診斷PTC的價(jià)值 超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221單一、聯(lián)合診斷均有較高曲線下面積（AUC），尤以聯(lián)合診斷最高。見表3。

表2 惡性組不同臨床病理特征患者超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較（±s）

表2 惡性組不同臨床病理特征患者超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較（±s）

注：與臨床分期Ⅰ～Ⅱ期者比較，*P＜0.05；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較，#P＜0.05。

臨床病理特征臨床分期Ⅲ～Ⅳ期Ⅰ～Ⅱ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 無n 106 70 96 80藍(lán)色面積比值（%）51.68±16.47*35.79±15.28 52.35±16.70#36.97±13.94彈性比值2.24±0.63*1.03±0.52 2.35±0.69#1.05±0.51血漿miR-663 1.94±0.89*3.40±1.15 1.86±0.89#3.31±1.17血漿miR-221 1.03±0.11*0.63±0.16 1.06±0.13#0.64±0.17

表3 超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221單一、聯(lián)合診斷PTC的價(jià)值

2.4 兩組甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)量比較 惡性組組織中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9表達(dá)量高于良性組，LC3、Beclin1表達(dá)量低于良性組（P均＜0.05）。見表4。

表4 兩組甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)量比較（±s）

表4 兩組甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)量比較（±s）

注：與良性組比較，*P＜0.05。

組別惡性組良性組n 176 176 Twist1 mRNA 117.62±13.57*90.84± 9.50 TPX2 mRNA 141.74±14.05*105.26±11.67 CXCR4 mRNA 131.29±15.72*107.68±12.37 ADAM9 mRNA 124.37±15.59*93.63±10.54 LC3 mRNA 63.29± 7.98*96.38±10.61 Beclin1 mRNA 78.49± 8.51*113.46±13.83

2.5 惡性組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221與甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)量的相關(guān)性 Pearson分析顯示，惡性組藍(lán)色面積比值、彈性比值、血漿miR-221水平與組織標(biāo)本中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9表達(dá)量呈正相關(guān)，與LC3、Beclin1表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05）；血漿miR-663水平與組織標(biāo)本中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與LC3、Beclin1表達(dá)量呈正相關(guān)（P均＜0.05）。見表5。

表5 惡性組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221與甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)量的相關(guān)性

3 討論

近年來，甲狀腺超聲憑借分辨率高、可重復(fù)性、無創(chuàng)等優(yōu)勢已成為臨床篩查PTC首選輔助檢查手段。超聲彈性成像是新型超聲檢查手段，借助人體組織在壓力作用下會(huì)發(fā)生形變原理，利用病灶組織及周圍正常組織間彈性差異，從而分辨有關(guān)組織彈性或硬度屬性，對甲狀腺結(jié)節(jié)具有潛在診斷價(jià)值［6-7］。BARDET等［8］研究發(fā)現(xiàn)，超聲彈性成像通過應(yīng)變率比值等定量指標(biāo)，有助于反映甲狀腺癌組織與同層正常甲狀腺組織硬度差異。本研究結(jié)果顯示，與甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者比較，PTC患者藍(lán)色面積比值、彈性比值更高，且隨臨床分期增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)明顯增長趨勢。這與張鵬等［9］研究觀點(diǎn)基本一致，惡性結(jié)節(jié)纖維組織大量增殖及腫瘤組織缺血可能是誘導(dǎo)局部區(qū)域彈性比值、藍(lán)色面積比值升高的主要機(jī)制。繪制ROC曲線顯示，當(dāng)彈性比值臨界值設(shè)定為1.37時(shí)，其診斷PTC的敏感度為82.96%。這提示超聲彈性成像對甲狀腺病變的判定具有良好前景，有望成為診斷PTC的有效影像學(xué)方法。另外，文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞促增殖基因與抗增殖基因表達(dá)紊亂是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的主要原因［10］，而侵襲基因異常表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是腫瘤惡性進(jìn)展的核心原因［11］；同時(shí)，自噬也是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要方式［12］。經(jīng)Pearson線性相關(guān)分析，PTC藍(lán)色面積比值、彈性比值與組織標(biāo)本中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9 mRNA表達(dá)量存在正相關(guān)關(guān)系，與LC3、Beclin1 mRNA表達(dá)量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。這說明超聲彈性成像參數(shù)可有效反映PTC腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、自噬活性，為其診斷及評估腫瘤惡性生物學(xué)行為提供了一定病理學(xué)依據(jù)。

miR-663、miR-221屬于miRNA成員，其可通過調(diào)節(jié)腫瘤增殖、凋亡、侵襲、自噬等相關(guān)基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前，一般認(rèn)為miR-221具有促癌作用，而miR-663在不同腫瘤類型中可發(fā)揮腫瘤抑制或促進(jìn)作用［13］。本研究結(jié)果顯示，惡性組血漿miR-221水平升高而miR-663水平降低，且臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者變化更顯著。這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［14］，表明miR-663、miR-221參與PTC的發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-221可抑制p27 kip1蛋白表達(dá)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，并通過抑制長壽保障基因、蛋白絡(luò)氨酸磷脂酶等表達(dá)，繼而參與PTC腫瘤細(xì)胞的分化、成長及轉(zhuǎn)移過程；miR-663表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞的抑制能力減弱，腫瘤細(xì)胞生長能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果也顯示，血漿miR-221水平 與PTC組 織 標(biāo) 本 中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，與LC3、Beclin1mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；而血漿miR-663水平與組織標(biāo)本中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與LC3、Beclin1表達(dá)量呈正相關(guān)。因此，miR-221、miR-663可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移?；谏鲜霾±韺W(xué)基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步分析其診斷價(jià)值。ROC曲線顯示，血漿miR-221、miR-663診斷PTC特異度為均小于73%，雖具有較一定診斷價(jià)值，但單獨(dú)應(yīng)用仍有一定局限性。故本研究采取聯(lián)合診斷模式，藍(lán)色面積比值、彈性比值及血漿miR-663、miR-221聯(lián)合診斷PTC的AUC為0.883，敏感度為80.11%，特異度為83.52%，充分說明三者聯(lián)合對提高PTC診斷價(jià)值具有積極意義，而其與PTC組織中增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)相關(guān)是其診斷的病理學(xué)基礎(chǔ)。因此，超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221聯(lián)合檢測可作為鑒別診斷甲狀腺疾病良惡性的有效輔助手段。