基于網絡藥理學預測柴胡、石菖蒲配伍治療抑郁癥的有效成分及作用機制

何偉偉，王豆，李濤，周瑞，閆詠梅

1陜西中醫藥大學，陜西咸陽 712046；2陜西中醫藥大學附屬醫院；3陜西省中藥資源產業化省部共建協同創新中心秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室（培育）陜西省創新藥物研究中心

抑郁癥以顯著而持續的心境低落為主要特征，臨床表現包括情緒焦慮、睡眠障礙、運動及精神遲緩、自責自罪及有自殺念頭等。WHO統計結果顯示，全球抑郁癥和惡劣心境患者發病率為12.8%，抑郁癥已成為全球性的重大醫療疾患［1］。目前對于抑郁癥的治療以化學藥物為主，但其治療效果存在一定局限性，如起效慢、容易反復發作等，還有一些患者存在對抗抑郁化學藥物無反應的情況。中醫學將抑郁癥歸于郁病范疇，對于郁病的治療早在《黃帝內經》中已有論述。近年來，中醫藥在治療抑郁癥方面顯示出了獨特的優勢。其中柴胡能疏肝解郁、和解表里、升舉陽氣，具有解熱、鎮痛、抗抑郁、抗炎、抗腫瘤等作用［2］；石菖蒲主風寒濕痹、咳逆上氣、開心孔、補五臟、通九竅、明耳目、出音聲，具有抗抑郁、抗癲癇、抗癡呆、改善學習記憶、抗驚厥等作用［3］。柴胡、石菖蒲配伍（柴胡—石菖蒲）在抑郁癥的治療與研究中應用廣泛，但目前研究多集中于對柴胡、石菖蒲單體作用成分的分析，而對其聯合后多成分、多靶點作用機制研究較少。2020年5月17日—10月21日，本研究運用網絡藥理學方法探討柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的有效成分及潛在作用機制，以期為中醫藥治療抑郁癥研究提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 柴胡—石菖蒲活性成分及作用靶點篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TC‐MSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索柴胡、石菖蒲的有效化學成分，以口服利用度（OB）≥30%、化合物類藥性（DL）≥0.18為條件篩選柴胡—石菖蒲活性成分；從平臺收集其相關作用靶點，并通過Uni‐prot蛋白數據庫（http：//www.uniprot.org）進行蛋白名標準化。采用Cytoscape 3.7.2軟件構建柴胡—石菖蒲活性成分—作用靶點可視化網絡圖，使用Net‐work analyzer工具對柴胡—石菖蒲主要活性成分進行網絡特征分析。網絡圖中圓形節點表示活性成分，菱形節點表示靶點，邊表示成分和靶點間的相互關聯；Degree表示活性成分與靶點的相互關聯的數目，圓形節點面積越大表示Degree值越大，Degree值越大代表該活性成分生物功能越多，重要性越強。

1.2 抑郁癥靶點收集和篩選 利用GeneCards數據庫（http：//www.genecards.org）、OMIM數據 庫（http：//www.omim.org）收集治療抑郁癥的潛在靶點。靶點Score值越高代表該靶點與疾病聯系越密切，設定Score大于中位數的靶點為在抑郁癥中發揮相對重要作用的靶點。合并2個數據庫靶點，刪去重復靶點并在Uniprot蛋白數據庫進行蛋白名標準化，得到抑郁癥靶點。

1.3 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心靶點分析 通過Venny 2.1.0在線繪圖軟件將柴胡—石菖蒲成分作用靶點與抑郁癥靶點取交集并制作韋恩圖，再將兩者交集靶點上傳到STRING 11.0數據庫（https：//string-db.org），生物種類設定為Homo sapiens，最小相互作用閾值設為highest confidence（＞0.9），獲取蛋白質相互作用數據。將所得信息導入Cyto‐scape 3.7.2軟件，利用內置工具Network analyzer進行分析，根據Degree＞10篩選核心靶點并繪制柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心靶點的可視化PPI網絡。PPI網絡中的網絡節點代表靶點，邊代表蛋白質相互作用關系，節點面積越大、顏色越紅代表該靶點生物學重要性越強。

1.4 核心靶點的GO生物過程和KEGG通路富集分析 將獲取的柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心靶點上傳至生物學信息注釋數據庫DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）平臺，物種設定為人，Select Identifier設定為OFFICIAL GENE SYMBOL，List Type設定為Gene List，對柴胡—石菖蒲抗抑郁靶點進行GO生物過程和KEGG通路富集分析，取P＜0.01且Count≥15的結果對柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的作用機制進行預測。

1.5 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心成分分析 根據P＜0.01篩選KEGG通路富集分析中排名最前的20條通路，采用Cytoscape 3.7.2軟件構建柴胡—石菖蒲活性成分—抑郁癥靶點—信號通路可視化網絡圖，通過Cytoscape 3.7.2內置工具Network analyzer分析活性成分及靶點的網絡拓撲參數，進一步明確柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的核心成分。網絡圖中圓形節點表示藥物活性成分，菱形節點表示潛在核心靶點，倒三角形節點表示作用通路，邊表示藥物活性成分與潛在靶點以及潛在靶點與作用通路間的相互作用關系，節點面積越大表示該節點生物學重要性越強。

2 結果

2.1 柴胡—石菖蒲活性成分及作用靶點篩選結果 TCMSP中共收集柴胡活性成分349種、石菖蒲活性成分105種，符合OB≥30%且DL≥0.18的柴胡活性成分12種、石菖蒲活性成分4種。共收集275個柴胡成分作用靶點、68個石菖蒲成分作用靶點，刪除柴胡、石菖蒲中重復的成分靶點后，再將兩種藥物成分靶點取交集，得到172個作用靶點。柴胡—石菖蒲中的主要活性成分為槲皮素、異鼠李素、山奈酚、豆甾醇、8-異戊烯基山奈酚等，見表1。柴胡—石菖蒲中發揮相對重要作用的靶點為原癌基因JUN、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤蛋白p53（TP-53）等，見OSID碼圖1。

2.2 抑郁癥靶點篩選結果 通過GeneCards數據庫收集抑郁癥相關靶點11 479個，經Score大于中位數篩選后獲得靶點1 946個，合并OMIM數據庫中抑郁癥相關靶點并去重復后，共獲得抑郁癥靶點1 960個。

2.3 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心靶點分析結果 將172個藥物成分靶點與1 960個抑郁癥相關靶點合并、取交集，得到98個柴胡—石菖蒲治療抑郁癥靶點。進一步篩選出柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核 心 靶 點21個，包 括AKT1、JUN、TNF、TP-53、MAPK1、白細胞介素6（IL-6）、MAPK8、表皮生長因子 受 體（EGFR）、MAPK14、c-fos原 癌 基 因 蛋 白（FOS）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、趨化因子8（CXCL8）、雌激素受體1（ESR1）、白細胞介素1B（IL-1B）、視網膜母細胞瘤蛋白1（RB1）、信號轉導與轉錄激活因子1（STAT1）、半胱天冬酶8（CASP8）、IL-2、表皮生長因子（EGF）、CCL2、蛋白激酶Cβ（PRKCB）。見OSID碼圖2。

表1 柴胡—石菖蒲的主要活性成分

2.3 核心靶點的GO生物過程和KEGG通路富集分析結果 GO生物過程分析共得到生物過程470條，其中P＜0.01且Count≥15的生物過程共12條，分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、信號轉導、對藥物的應答、DNA模板轉錄的正調控、凋亡過程、凋亡過程的負調控、細胞增殖的負調控、細胞增殖的正調控、炎癥應答、衰老、血管再生、氧化還原過程。KEGG信號通路分析共獲得信號通路123條，其中P＜0.01且Count≥15的信號通路共16條，包括腫瘤途徑、乙型肝炎、TNF信號通路、恰加斯病、弓形體病、甲型流感、肺結核、缺氧誘導因子1信號通路、Toll樣受體信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路、MAPK信號通路、癌癥蛋白多糖、丙型肝炎、黏著斑、人類T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型感染、癌癥微小RNAs。

2.4 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心成分分析結果 柴胡—石菖蒲活性成分—抑郁癥靶點—信號通路網絡中共包括133個節點、528條邊，見OSID碼圖3。柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的核心成分Degree值從高到低依次為槲皮素、8-異戊烯基山奈酚、山奈酚、豆甾醇、異鼠李素。見表2。

表2 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心成分網絡參數分析結果

3 討論

柴胡具有疏肝解郁之功，是治療郁病的要藥，在四逆散、逍遙散、柴胡疏肝散等許多理氣劑中均有重要作用。石菖蒲豁痰開竅、醒神益智，對中樞神經系統疾病具有治療作用［4］。柴胡—石菖蒲在臨床治療抑郁癥中應用廣泛。研究發現，將柴胡皂苷與石菖蒲提取液聯合運用，可顯著增強石菖蒲水提液和醇沉液治療抑郁癥的效果［5］。本研究通過分析柴胡—石菖蒲的活性成分及作用靶點發現，兩種藥物共有16種活性成分，172個作用靶點，槲皮素、8-異戊烯基山奈酚、山奈酚、豆甾醇、異鼠李素為柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的核心成分，其中山奈酚為柴胡—石菖蒲所共有的活性成分。研究顯示，槲皮素可改善促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）誘導的大鼠焦慮、抑郁樣行為［6］。炎癥反應與抑郁癥的發生密切相關，當核轉錄因子κB（NF-κB）通路過度激活時，可引起炎癥反應并進一步影響情緒中樞，可能會導致抑郁樣行為［7］。而8-異戊烯基山奈酚作為NF-κB通路的抑制劑，對由NF-κB調節的典型炎癥基因表達具有負向調控作用［8］。研究發現，山奈酚能改善抑郁模型大鼠海馬的損傷，并能減少海馬神經元凋亡［9］。另有研究顯示，在抑郁癥的發病機制中，細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）和環磷腺苷反應元件結合蛋白（CREB）發揮重要作用［10］；而豆甾醇能顯著提高海馬ERK和CREB的表達水平，從而改善抑郁癥狀［11］。研究表明，異鼠李素可以降低前額葉皮質、海馬膽堿酯酶及腦源性神經營養因子的活性，增強膽堿信號轉導和突觸可塑性，通過改善神經功能、增強認知和記憶從而預防和治療神經退行性疾病［12］。

柴胡—石菖蒲治療抑郁癥靶點PPI網絡顯示，JUN、AKT1、TNF、TP53、MAPK1、IL-6等核心靶點在柴胡—石菖蒲對于抑郁癥的治療中具有相對重要的作用。相關文獻顯示，AKT1、MAPK1靶點可能是抗抑郁治療的關鍵靶點［13-15］。研究發現，JUN與抑郁癥關系密切，其可能是抗抑郁藥物發揮作用的傳導物質；此外，還發現其與抑郁癥主要發病機制之一的神經再生有關［16］。遺傳學研究發現，IL-6基因是抑郁障礙的重要易感基因，單相與雙相抑郁發作患者的血清IL-6水平顯著升高，并與其病情的嚴重程度一致［17-18］。

GO生物學過程富集分析顯示，柴胡—石菖蒲治療抑郁癥主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、信號轉導、DNA模板轉錄的正調控、凋亡過程等生物學過程。KEGG信號通路富集分析顯示，PI3K-AKT、MAPK、Toll樣受體信號通路等信號通路可能為柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的關鍵通路。PI3K-AKT信號通路在抑郁癥的發病過程中具有重要作用，突觸可塑性是抑郁癥發病機制之一，PI3KAKT信號通路可通過影響突觸可塑性緩解抑郁癥狀［19］。此外，抑郁患者海馬損傷與海馬神經細胞凋亡增加有關，而PI3K-AKT可通過抑制NF-κB信號通路抑制細胞凋亡，從而起到抗抑郁作用［20］。研究顯示，MAPK信號通路可通過調控細胞增殖、分化及凋亡影響抑郁癥的發生并參與抗抑郁藥物的治療機制［21］。目前已經證明的MAPK信號通路共有5條，其中與抑郁癥關系最為密切的是ERK1/2信號通路，該信號通路為抗抑郁藥物首要作用目標，也是參與細胞可塑性的重要途徑［22］。神經發生是抑郁癥發病機制之一。研究表明，通過調控細胞增殖、分化以及凋亡，Toll樣受體信號通路可影響神經發生、軸突生長和結構重塑，從而起到抗抑郁作用［23］。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的作用機制進行了初步探索，其中涉及了多種成分、靶點、生物過程及信號通路。柴胡—石菖蒲的活性成分可通過JUN、AKT1、TNF等核心靶點作用于RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、信號轉導等生物學過程及PI3K-AKT、MAPK等信號通路，協同發揮治療抑郁癥的作用。