電針預(yù)處理對(duì)慢性炎性痛大鼠脊髓背角組織中mTOR-自噬通路活性的影響

呂丹，欒靜，楊艷梅，賀永進(jìn)

天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192

炎性痛廣泛存在于各種急慢性疾病的進(jìn)程中［1］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。已有研究表明，電針對(duì)炎性痛具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用［2-4］，但其具體機(jī)制目前尚不明確。本課題組前期工作表明，自噬通路障礙參與了大鼠炎性痛的形成和維持［5］。細(xì)胞通過自噬形成自噬體，進(jìn)而利用溶酶體降解細(xì)胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)和受損細(xì)胞器，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、代謝和細(xì)胞功能的自身穩(wěn)態(tài)有重要作用［6］。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路參與自噬的負(fù)調(diào)控過程，在相關(guān)信號(hào)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。mTOR信號(hào)通路通過調(diào)控局部蛋白合成，對(duì)于慢性炎性痛所致的疼痛敏化起重要作用。目前，電針的抗炎鎮(zhèn)痛作用是否通過調(diào)控mTOR-自噬通路完成尚無相關(guān)報(bào)道。2018年1月—2020年1月，本研究擬觀察電針預(yù)處理對(duì)慢性炎性痛大鼠脊髓背角組織中mTOR-自噬通路的影響，為明確其抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康成年雄性SD大鼠（體質(zhì)量180～240 g，天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）32只，飼養(yǎng)于室溫（22～26℃）、晝夜交替的環(huán)境中。主要試劑：蜜蜂毒和RIPA細(xì)胞裂解液（Sigma公司，美國）；自噬相關(guān)蛋白（LC3Ⅱ、Beclin-1、p62）及mTOR相關(guān)信號(hào)通路蛋白（mTOR、p-mTOR、S6K、p-S6K）一抗（Cell Signaling technology公司，美國）；二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔或鼠抗體（北京中杉金橋公司）；內(nèi)參β-Tubulin一抗（Sigma公司，美國）。主要儀器：von-Frey纖維（Stoelting公司，美國）；電針治療儀（G6805，上海涵飛醫(yī)療器械有限公司）；熱刺激儀（RTY 3型，西安鳳嵐儀器廠）；低溫離心機(jī)（Beckman公司L-90K，美國）；電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司Mini-Pro和Trans-Blot SD，美國）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Alpha Innotech公司，美國）。

1.2 動(dòng)物分組與造模處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組（C組）、炎性痛組（IP組）、電針預(yù)處理組（EA組）、非穴位電針預(yù)處理組（NE組）各8只。IP組、EA組、NE組大鼠左側(cè)后肢足底皮下注射蜜蜂毒溶液0.2 mg/50μL制備慢性炎性痛模型［7］，C組同部位注射等體積無菌生理鹽水；EA組造模前3 d每天給予左側(cè)陽陵泉、足三里電針刺激（疏密波，頻率2 Hz，電流2 mA，刺激時(shí)間30 min），電針結(jié)束后1 h造模；NE組左側(cè)陽陵泉、足三里旁開5 mm給予電針刺激，余方法同EA組。

1.3 痛閾測(cè)定 造模后2 h，測(cè)定各組大鼠機(jī)械刺激縮足閾（MWT）和熱刺激縮足潛伏期（TWL）。將待測(cè)大鼠置于金屬網(wǎng)格墊（30 cm高）上并適應(yīng)30 min，使用Von-Frey纖維按由小到大（1.0、2.5、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 g）的刺激強(qiáng)度順序反復(fù)刺激大鼠足底中心10次，每次間隔3～5 s，MWT為出現(xiàn)50%以上縮足反射的強(qiáng)度。熱刺激儀設(shè)置100 W鹵素投射燈和10 V電壓，調(diào)整燈源與玻璃板的距離直至獲得5 mm足底照射光圈直徑。TWL為從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時(shí)間（s），同一部位間隔10 min測(cè)量1次，重復(fù)3～5次，取平均值作為最終指標(biāo)；為避免足底組織過度熱損傷，＞30 s無反應(yīng)則停止照射。

1.4 脊髓背角組織中自噬及mTOR相關(guān)信號(hào)通路蛋白檢測(cè) 痛閾測(cè)定結(jié)束后，處死大鼠；液氮冷凍研磨脊髓背角組織后，加入預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液；冰上勻漿后，低溫離心機(jī)內(nèi)4℃下20 000 r/min離心10 min，上清即為組織總蛋白。取蛋白樣品，行SDS-PAGE凝膠電泳；將電泳后的凝膠與NC膜、超厚轉(zhuǎn)移用濾紙一起置于半干電轉(zhuǎn)槽上轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；分別加入LC3Ⅱ、Beclin-1、p62抗體一抗（1∶1 000），mTOR、p-mTOR、S6K、p-S6K抗體一抗（1∶500），β-Tubulin抗體（1∶10 000），4℃過夜；PBST漂洗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或鼠抗體（1∶5 000）室溫孵育1 h；采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，使用FluorChemⅡ分析軟件分析圖像，以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MWT、TWL比較 與C組比較，IP組和NE組MWT降低、TWL縮短（P均＜0.01），EA組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與IP組比較，EA組MWT升高、TWL延長（P均＜0.01），NE組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1各組MWT、TWL比較（±s）

表1各組MWT、TWL比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.01；與IP組比較，#P＜0.01。

組別EA組NE組IP組C組n 8 8 8 8 MWT（g）25.54±1.60#8.07±1.14*8.11±1.92*30.24±2.31 TWL（s）11.42±0.37#5.78±0.51*5.23±0.57*12.35±1.07

2.2 各組大鼠脊髓背角組織中自噬及mTOR相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 與C組比較，其余各組脊髓背角組織中LC3Ⅱ、Beclin-1和p62表達(dá)上調(diào)，IP組和NE組脊髓背角組織中p-mTOR、p-S6K表達(dá)上調(diào)（P均＜0.05）；與IP組比較，EA組脊髓背角組織中LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)上調(diào)而p62、p-mTOR、p-S6K表達(dá)下調(diào)（P均＜0.05），NE組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠脊髓背角組織中自噬及mTOR相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠脊髓背角組織中自噬及mTOR相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與IP組比較，#P＜0.05。

組別EA組NE組IP組C組n 8 8 8 8 LC3Ⅱ0.79±0.15*#0.61±0.11*0.65±0.24*0.37±0.08 Beclin-1 1.04±0.23*#0.70±0.19*0.73±0.28*0.46±0.11 p62 0.69±0.21*#1.21±0.26*1.38±0.17*0.54±0.14 p-mTOR 0.87±0.11 1.57±0.14*1.89±0.19*0.82±0.24 mTOR 0.83±0.21 0.98±0.19 1.19±0.14 0.91±0.15 p-S6K 0.79±0.15#1.62±0.08*1.54±0.15*0.85±0.22 S6K 1.01±0.16 0.99±0.22 1.09±0.24 0.88±0.17

3 討論

針灸療法是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法，臨床治療和相關(guān)研究均表明電針刺激可以緩解慢性持續(xù)性疼痛，例如慢性炎性痛、神經(jīng)性痛和癌性痛等。有研究表明，電針可抑制脊髓中外周炎癥誘導(dǎo)的Fos蛋白表達(dá)［8］，還可抑制脊髓阿片類物質(zhì)、血清素、去甲腎上腺素、谷氨酸、膠質(zhì)細(xì)胞/細(xì)胞因子及信號(hào)分子等引起的脊髓水平傷害性信息的傳遞［9-11］。然而，電針抗炎鎮(zhèn)痛作用的分子信號(hào)機(jī)制尚不明確，對(duì)于該機(jī)制的研究為本文的研究重點(diǎn)。

本課題組前期研究已證實(shí)，自噬通路障礙參與了大鼠炎性痛的形成和維持［5］。自噬是真核細(xì)胞維持其自身穩(wěn)態(tài)的高度保守行為，主要調(diào)節(jié)方式為降解細(xì)胞內(nèi)受損的大分子物質(zhì)或者細(xì)胞器［6］。在生理狀態(tài)下，自噬處于較低水平；在各種病理刺激下（感染、創(chuàng)傷、營養(yǎng)缺乏、缺氧、缺血等），自噬會(huì)被激活，從而啟動(dòng)細(xì)胞相應(yīng)的應(yīng)激防御［12］。細(xì)胞自噬涉及多種信號(hào)通路，其中mTOR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)抑制自噬方面起著關(guān)鍵作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時(shí)，增強(qiáng)自噬能抑制神經(jīng)元凋亡［13］，而抑制自噬則會(huì)導(dǎo)致凋亡增加［14］。

LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母自噬相關(guān)基因8的同源物，是最常用的自噬蛋白標(biāo)志物［15］；Beclin-1通過調(diào)節(jié)自噬的起始來調(diào)節(jié)自噬水平，細(xì)胞內(nèi)Beclin-1表達(dá)水平增高意味著細(xì)胞自噬增強(qiáng)；p62作為一種特異的泛素結(jié)合蛋白，在自噬過程中可與LC3選擇性結(jié)合并轉(zhuǎn)入到自噬體，進(jìn)而形成自噬溶酶體并被降解，p62的蓄積增多表明自噬過程受到抑制［16］。另外，現(xiàn)有研究表明，自噬主要通過mTOR依賴的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)控［17］。作為一種重要的信號(hào)調(diào)節(jié)通路，mTOR-自噬通路參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、核糖體合成、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞能量代謝等多種途徑，進(jìn)而在生理病理過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明，與C組比較，IP組、EA組、NE組脊髓背角組織中LC3Ⅱ、Beclin-1和p62表達(dá)上調(diào)；與IP組比較，EA組脊髓背角組織中LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)上調(diào)而p62表達(dá)下調(diào)。這提示在大鼠炎性痛形成和維持過程中脊髓背角細(xì)胞自噬功能受到抑制，電針預(yù)處理可誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)；從而證實(shí)mTOR通路是調(diào)控自噬功能的重要信號(hào)途徑，電針預(yù)處理對(duì)大鼠炎性痛的改善作用是通過增強(qiáng)脊髓背角細(xì)胞自噬功能實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與C組比較，IP組和NE組脊髓背角組織中p-mTOR和p-S6K表達(dá)上調(diào)；與IP組比較，EA組脊髓背角組織中p-mTOR和p-S6K表達(dá)下調(diào)。這提示在大鼠炎性痛形成和維持過程中mTOR信號(hào)通路被激活，脊髓背角細(xì)胞自噬功能被抑制。因此，我們認(rèn)為電針預(yù)處理通過調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)脊髓背角細(xì)胞自噬功能，最終產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛的作用。