miR-106a-5p靶向調控ERK2對胃癌細胞順鉑耐藥性的影響及其分子機制

楊萬荷，李家群，張東艷，王昌高，昝慧

1海南省人民醫院，海口 570100；2海口市人民醫院

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，其早期癥狀不典型且復發率較高，導致許多患者的生存預后不佳［1］。化療是胃癌綜合治療的重要部分，術后化療有助于消滅局部微小轉移灶，減少腫瘤局部復發。但部分患者術后化療過程中出現對化療藥物耐藥的現象，導致治療效果不佳。細胞耐藥與藥物代謝異常、DNA修復功能增強及細胞增殖及凋亡相關基因表達異常相關，但具體機制尚不明確［2］。因此，有必要深入研究胃癌耐藥發生的機制，尋找新的診斷治療靶點。微小RNA106a-5p（miR-106a-5p）是miR-17家族成員之一，其在結直腸癌、腎細胞癌等多種腫瘤中異常表達，可影響轉化生長因子β2受體等基因表達，從而調控腫瘤的發生發展過程［3-4］。細胞外信號調節激酶2（ERK2）屬于MAP激酶家族成員，可參與細胞增殖、分化、轉錄調控和發育等多種細胞過程。研究表明，ERK2在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中異常表達，并可促進腫瘤細胞的增殖及轉移，與患者不良預后相關［5-6］。有學者發現，卵巢癌及甲狀腺癌細胞中抑制miR-106a-5p表達后，ERK2表達顯著上調，腫瘤細胞增殖及遷移能力增強且對化療藥物順鉑（DDP）的耐藥性提高［7-8］。2018年10月—2020年1月，我們通過建立胃癌DDP耐藥細胞株MGC-803/DDP，初步探討miR-106a-5p靶向調控ERK2對胃癌DDP耐藥性的影響并分析其可能機制，以期為臨床胃癌化療耐藥患者的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胃癌細胞系MGC-803購自中國協和細胞庫，DDP購自Hospira公司。主要試劑：RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）、胰酶、4%多聚甲醛固定液、結晶紫染液均購自北京索萊寶公司。Cyclin D1、Caspase3、ERK2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MDR1一抗均購自Abcam公司。二抗HRP-linked anti-rabbit IgGantibody購自Cell Signaling Technology公司。EdU增殖檢測試劑盒及Hoechst33258染色試劑盒購自上海一研生物公司。Annexin-V試劑盒購自MultiSciences公司。PI購自PeproTech公司。FACSCalibur流式細胞儀購自BD Biosciences公司。Transwell細胞培養板購自Corning公司。Matrigel基質膠購自BD公司。RNeasy Plus Mini Kit購自Qiagen公司。SYBR?Green PCR Master Mix購自ABI公司。miRNA RT試劑盒購自海南基因公司。miR-106a-5p模擬物（miR-106a-5p mimic）、ERK2過表達質粒（pcDNA3.1-ERK2）、ERK2野生型質粒（ERK2-WT）、ERK2突變型質粒（ERK2-MUT）、對照質粒（NCmimic）均購自華大基因公司。

1.2 細胞培養及DDP耐藥細胞株建立 將胃癌細胞系MGC-803置于含10%FBS的RPMI1640培養基中，37℃、5%CO2培養箱中培養。當MGC-803細胞生長至對數生長期時，將DDP由0.5 mg/L開始誘導，每48 h更換一次培養基。待細胞狀態穩定，即達到對數生長期后，梯度增加25%的DDP濃度，直到細胞能夠穩定存活于5 mg/L的DDP培養基中并能夠連續傳代培養，表明MGC-803/DDP耐藥細胞株建立成功。

1.3 細胞miR-106a-5p、ERK2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取對數生長期的MGC-803及MGC-803/DDP細胞，以1×106/mL接種至6孔板，待細胞融合度達80%后按照Qiagen RNeasy Plus Mini Kit說明提取MGC-803及MGC-803/DDP細胞總RNA，使用miRNA RT試劑盒進行逆轉錄得到cDNA。使用SYBR?Green PCR Master Mix在Bio-Rad CFX 96 Touch實時PCR檢測系統上進行RT-PCR分析。miR-106a-5p QRT-PCR參數設置：95℃10 s，95℃10 s，60℃30 s，在70℃延伸10 s，共40個循環；ERK2 QRT-PCR參數設置：95℃10 s，95℃40 s，60℃60 s，70℃10 s，共35個循環。引物序列：miR-106a-5p上游引物5′-GATGCTCAAAAAGTGCTTA‐CAGTGCA-3′、下 游 引 物5′-TATGGTTGTTCT‐GCTCTCT-3′，內參U6上游引物5"-CTCGCTTCG‐GCAGCACA-3、下 游 引 物5"-CCAGTGCAGGGTCC‐GAGGTAT-3"；ERK2上游引物5′-TGGATTCGACT‐TAGACTTGACCT-3′、下游引物5′-GGTGGGTTATG‐GTCTTCAAAAGG-3′，內 參β-actin上 游 引 物5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′、下 游 引 物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。以U6、β-actin為內參，按照2－ΔΔCt計算miR-106a-5p及ERK2 mRNA的相對表達量。

1.4 miR-106a-5p與ERK2靶向調控關系分析 采用在線生物學信息學軟件結合位點預測及熒光素酶報告基因實驗。使用在線生物學信息學軟件star‐Base（http：//starbase.sysu.edu.cn/）和Targetscan7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）預測程序預測miR-106a-5p與ERK2是否存在結合位點；將MGC-803/DDP細胞以5×104/孔接種到24孔板中，接種12 h后隨機分為4組，分別進行ERK2-WT、ERK2-MUT與miR-106a-5p mimic、NCmimic的共轉染，室溫孵育48 h后，使用雙熒光素酶測定系統（Promega公司）和微板發光計（Berthold公司）測定熒光素酶活性。

1.5 細胞分組轉染 將MGC-803/DDP細胞以1×106/mL鋪至6孔板，分為mimic組（轉染miR-106a-5p mimic）、ERK2組（轉染pcDNA3.1-ERK2）、mimic+ERK2組（共轉染miR-106a-5p mimic和pcDNA3.1-ERK2）、NC組（不轉染），每組設3個復孔。采用LipofectamineTM3000轉染試劑按照分組進行轉染，轉染48 h后收集4組細胞，參照“1.3”采用RT-PCR法檢測miR-106a-5p、ERK2表達。結果顯示，mimic組miR-106a-5p相對表達量（30.09±3.39）高于NC組（0.51±0.11），ERK2組ERK2相對表達量（10.23±1.58）高于NC組（3.10±0.36），mimic+ERK2組miR-106a-5p、ERK2相對表達量（27.13±3.14、6.12±1.29）均高于NC組（P均＜0.05），提示轉染成功。

1.6 細胞增殖能力觀察 采用EdU染色實驗。收集“1.5”中轉染48 h后的各組細胞，換液后加入20μmol/L的DDP，24 h后棄液，PBS清洗3次，各孔加入200μL EdU培養基（細胞培養基與EdU溶液按1 000∶1稀釋），孵育2 h，棄培養基，PBS清洗細胞2次。各孔加入100μL細胞固定液（含4%多聚甲醛的PBS）室溫孵育30 min，棄固定液；加入100μL 2 mg/mL甘氨酸，搖床孵育5 min；加入200μL PBS，搖床清洗5 min，棄液；加入200μL 1×Apollo?染色反應液，避光、室溫、搖床孵育30 min；加入100μL滲透劑（0.5%TritonX-100的PBS），搖床清洗2～3次，每次10 min。DNA染色：各孔加入200μL 1×Hoechst 33342反應液，避光、室溫、搖床孵育30 min，加入200μL PBS清洗3次。染色完成后立即進行熒光顯微鏡DNA復制活性檢測，EdU陽性細胞數越多說明細胞增殖能力越強。

1.7 細胞凋亡水平觀察 采用流式細胞術。收集“1.5”中各組細胞，在37℃下進行胰蛋白酶消化處理1 min；每組收集1×106～3×106個細胞，冷PBS清洗2次；4℃下離心5 min，重懸于500μL凋亡陽性對照緩沖液中，冰上孵育30 min；冷PBS清洗，去上清。加入適量預冷1×結合緩沖液重懸，加入數量相同且未經處理的腫瘤細胞與之混合。加入預冷1×結合緩沖液補充至1.5 mL，等分為3管（空白對照管1管、單染管2管）。單染管分別加入5μL Annexin VFITC及10μL PI，室溫下避光孵育5 min。將5μL Annexin-V-FITC溶液加入細胞中，并在室溫下避光孵育15 min。在流式細胞儀上用空白對照管調節FSC、SSC和熒光通道電壓，進行流式分析，通過FITC檢 測 通 道（Ex=488 nm；Em=530 nm）檢 測Annexin-V-FITC，通過PI檢測通道（Ex=535 nm；Em=615 nm）檢測PI。使用流式細胞儀測定細胞凋亡，BDFACSCantoTM系統軟件測定細胞凋亡數。

1.8 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell實驗。制備基質膠鋪板：將基質膠Matrigel用RPMI1640培養基以1∶8稀釋，37℃下放置30 min使Matrigel聚合成凝膠；基底膜水化后，將Matrigel包被24孔板Tran‐swell小室底部膜的上室面。制備細胞懸液：胰酶消化細胞，含血清培養基終止消化后離心棄去培養液；用PBS清洗1～2遍，調整細胞密度至5×105/mL，用無血清培養基重懸。細胞接種：取100μL細胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入600μL含20%FBS的培養基。放置細胞培養箱中培養24 h后取出Transwell小室，棄去孔中培養液，PBS清洗2遍，甲醇固定30 min，將小室適當風干后用0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，PBS清洗3遍。400倍顯微鏡下隨機5個視野觀察細胞，采用鏡下直接計數法計算膜下室側貼壁細胞數，貼壁細胞數越多表示細胞侵襲能力越強。

1.9 細胞增殖凋亡、上皮間質轉化相關蛋白及耐藥基因檢測 采用Western blotting法。將各組細胞以1×105/孔鋪至6孔板，待細胞貼壁后加入20μmol/L DDP處理24 h；PBS清洗2遍，加入含蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA細胞裂解液進行裂解，提取細胞總蛋白。蛋白定量后，加入上樣緩沖液，99℃水浴10 min后進行SDS-PAGE膠電泳（濃縮膠恒壓80 V、分離膠恒壓120 V、恒壓80 V轉印2 h）。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入增殖凋亡相關蛋白（Cyclin D1、Caspase3）、上皮間質轉化相關蛋白（Ecadherin、N-cadherin、Vimentin）、耐藥基因（MDR1）一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜；加入二抗（稀釋比例1∶5 000），室溫孵育1 h。采用ECL暗室顯影照相，Image J軟件分析條帶灰度值，計算各蛋白相對表達量。

1.10 細胞DDP耐藥性檢測 采用MTT法。收集轉染后的各組細胞，消化重懸后調整細胞密度為1×104/mL；接種至96孔板，加入細胞懸液100μL，置入細胞培養箱內培養24 h；分別加入濃度為40、20、2、0.2、0.02μg/mL的DDP，每個藥物濃度設置3個復孔，同時設置不接種細胞的空白對照孔及不加藥物的對照孔，放入細胞培養箱中培養2 d；加入20μL MTT，4 h后應用酶標儀檢測570 nm處各孔光密度（OD）值，取各復孔OD值的平均值計算各濃度DDP對各組細胞生長的抑制率。抑制率=（對照孔OD值－實驗孔OD值）/對照孔OD值×100%，根據抑制率計算各組細胞的半數抑制濃度（IC50）。IC50越低，說明細胞對DDP治療越敏感，即耐藥性越低。

1.11 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，兩組比較行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞中miR-106a-5p、ERK2 mRNA表達比較 MGC-803/DDP細胞中miR-106a-5p相對表達量低于MGC-803細胞，ERK2 mRNA相對表達量高于MGC-803細胞（P均＜0.05）。見表1。

2.2 miR-106a-5p與ERK2的調控關系 預測顯示，ERK2基因序列445～452個堿基位置存在與miR-106a-5p的結合位點，見圖1。共轉染miR-106a-5p mimic+ERK2-WT或NCmimic+ERK2-WT的MGC-803/DDP細胞熒光素酶活性分別為1.91±0.29、3.39±0.51（P＜0.01），共 轉 染miR-106a-5p mimic+ERK2-MUT或NCmimic+ERK2-MUT的MGC-803/DDP細胞熒光素酶活性分別為3.51±0.49、3.61±0.59（P＞0.05），提示miR-106a-5p可靶向負調控ERK2。

表1 MGC-803、MGC-803/DDP細胞中miR-106a-5p、ERK2 mRNA表達比較（-x±s）

圖1 miR-106a-5p與ERK 2結合位點

2.3 各組細胞增殖、凋亡、侵襲能力比較 EdU陽性細胞數ERK2組＞NC組＞mimic+ERK2組＞mimic組，細胞凋亡數mimic組＞NC組＞mimic+ERK2組＞ERK2組，貼壁細胞數ERK2組＞NC組＞mimic+ERK2組＞mimic組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞Ed U陽性細胞數、細胞凋亡數、貼壁細胞數比較（個，-x±s）

2.4 各組細胞增殖凋亡、上皮間質轉化相關蛋白及耐藥基因表達比較 Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin、MDR1表達ERK2組＞mimic+ERK2組＞NC組＞mimic組，Caspase3、E-cadherin表 達mimic組＞mimic+ERK2組＞NC組＞ERK2組（P均＜0.05）。見表3。

2.5 各組細胞DDP耐藥性比較 mimic組、ERK2組、mimic+ERK2組、NC組IC50分別為（1.51±0.08）、（7.58±0.14）、（3.67±0.12）、（4.46±0.11）μg/mL，ERK2組＞NC組＞mimic+ERK2組＞mimic組（P均＜0.05）。

3 討論

我國胃癌發病率較高，胃癌的發病例數和死亡例數約占全球總病例數的50%［9］。以鉑類為基礎的化療是晚期胃癌綜合治療的重要手段，但臨床用藥過程中存在耐藥，甚至多藥耐藥，嚴重影響治療效果。胃癌耐藥機制的形成較為復雜，與DNA修復功能增強、藥物靶點改變、幽門螺桿菌感染及細胞藥泵效應或解毒效應增強有關［10］。因此，研究DDP耐藥性的機制，尋找逆轉DDP耐藥性的方法，可能是提高DDP耐藥的胃癌患者化療療效的關鍵。

表3 各組細胞增殖凋亡、上皮間質轉化相關蛋白及耐藥基因表達比較（-x±s）

ERK2是一種細胞外信號調節激酶，參與細胞增殖、分化和發育等生物學過程。研究顯示，腫瘤中的ERK2能夠被細胞膜相應受體如血管內皮生長因子受體、轉化生長因子β受體過度磷酸化激活，由細胞質轉位至細胞核，激活下游激酶，導致腫瘤細胞惡性增殖的同時產生對化療藥物的耐藥性［11］。miR-106a-5p是miR-106a的剪切成熟體，其能夠通過調控細胞表面Fas相關絲蘇氨酸激酶的活性，影響下游ERK1/2的表達及活性，調控腫瘤細胞的增殖及凋亡［12］。有學者報道，鼻咽癌腫瘤細胞中miR-106a-5p表達水平升高能夠通過下調ERK2信號傳導通路的激活來逆轉腫瘤細胞化療耐藥［13］。因此，miR-106a-5p可能通過直接下調ERK2表達逆轉MGC-803/DDP細胞對DDP的耐藥性。為驗證該假設，我們首先檢測了MGC-803及MGC-803/DDP中miR-106a-5p及ERK2 mRNA表達差異，發現MGC-803/DDP細胞中miR-106a-5p表達降低、ERK2 mRNA表達升高。通過生物信息學軟件分析發現miR-106a-5p與ERK2 mRNA的3"UTR存在連續結合的位點，熒光素酶報告實驗進一步確認miR-106a-5p能夠靶向抑制ERK2 mRNA的表達。因此，我們推測miR-106a-5p/ERK2可能在MGC-803/DDP耐藥細胞株中發揮重要的生物學功能。為進一步驗證該假設，本研究通過在MGC-803/DDP細胞中轉染ERK2過表達質粒或miR-106a-5p模擬物，觀察其對細胞增殖凋亡及侵襲能力的影響。結果顯示，miR-106a-5p mimic能夠靶向ERK2降低DDP處理下MGC-803/DDP細胞的增殖及侵襲能力，提高細胞凋亡水平，提示miR-106a-5p能夠通過靶向抑制ERK2表達逆轉MGC-803/DDP細胞對DDP的耐藥性。另外，miR-106a-5p亦可通過其他分子機制影響腫瘤細胞對DDP的耐藥性。研究顯示，抑制miR-106a表達能通過靶向上調多囊腎病基因2表達促進腫瘤細胞的凋亡，并導致腫瘤細胞G1/S期阻滯，增強非小細胞肺癌細胞對DDP的耐藥性，而上調miR-106a后腫瘤細胞對DDP的敏感性升高［14］。

為進一步探討miR-106a-5p通過ERK2逆轉MGC-803/DDP細胞對DDP耐藥性的具體機制，我們檢測了各組MGC-803/DDP細胞增殖凋亡相關蛋白Cyclin D1、Caspase3的表達，結果顯示，與ERK2組比較，mimic+ERK2組及mimic組Cyclin D1表達均較低，而Caspase3表達均較高；而mimic+ERK2組Cyclin D1表達較mimic組高，Caspase3表達較mimic組低。腫瘤的發生發展與細胞周期失控相關，細胞周期的進行依賴于一系列正負調節因子的作用，包括細胞周期素（如Cyclin D1等）和細胞周期素依賴激酶抑制蛋白。Cyclin D1可推動細胞周期由G1期進展到S期，而細胞周期素依賴激酶抑制蛋白可抑制細胞從G1期到S期過渡。有研究報道，結直腸癌細胞Cyclin D1表達增加可誘導腫瘤細胞的化療耐藥性，而抑制Cyclin D1表達能夠增強化療敏感性［15］。本研究結果亦提示，miR-106a-5p能夠通過靶向抑制ERK2，導致Cyclin D1表達降低，從而抑制MGC-803/DDP細胞的增殖能力。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。本研究顯示，miR-106a-5p能夠增加Caspase-3的表達，進而促進MGC-803/DDP細胞凋亡。上皮間質轉化是腫瘤細胞發生浸潤轉移的重要機制，主要表現為維持細胞之間黏附的上皮性表型如E-cadherin表達水平降低，而間質性表型如N-cadherin及Vimentin表達升高，導致細胞浸潤轉移能力增強［16］。研究顯示，腫瘤細胞發生上皮間質轉化與腫瘤化療耐藥性的產生密切相關，上皮間質轉化相關信號通路的激活可參與腫瘤耐藥性的形成，靶向上皮間質轉化的治療可能是克服腫瘤耐藥的新思路［17］。此外，有學者在舌鱗癌的研究中發現，上皮間質轉化過程中的關鍵轉錄因子Twist能夠促進間質性標志物N-cadherin及Vimentin表達升高，并促進鱗癌細胞對DDP耐藥性的形成［18］。有研究報道，ERK2是促進腫瘤細胞上皮間質轉化過程的關鍵上游信號分子，并且是導致腫瘤細胞耐藥的重要分子［19］。本研究結果顯示，miR-106a-5p可通過靶向抑制ERK2活性導致E-cadherin表達降低，N-cadherin及Vimentin表達升高，從而抑制MGC-803/DDP細胞的侵襲能力。本研究對耐藥基因MDR1水平的檢測結果同樣顯示，miR-106a-5p可靶向ERK2使MDR1表達水平降低，進而逆轉MGC-803/DDP細胞的耐藥性。

綜上所述，miR-106a-5p能夠通過靶向抑制ERK2表達降低MGC-803/DDP細胞增殖、侵襲能力，增加MGC-803/DDP細胞凋亡水平并逆轉其耐藥性，該機制可能與改變增殖凋亡相關蛋白Cyclin D1和Caspase3表達、逆轉上皮間質轉化過程、降低耐藥基因MDR1表達水平有關。