基于HPLC的益腦心顆粒特征圖譜分析方法的建立

王 鑫,黃美玲,李建宏,任曉東,羅 丹,陳明會*

(1漢中市人民醫院藥劑科,漢中 723000;2漢中市鐵路中心醫院重癥醫學科;3西安交通大學第一附屬醫院藥學部;*通訊作者,E-mail:951036067@qq.com)

益腦心顆粒(國藥準字Z20025079,為陜西漢王藥業股份有限公司獨家品種)由川芎、制首烏、丹參、郁金、山楂、天麻六味中藥組成,具有活血散瘀,平肝熄風等功效,用于血瘀肝旺所致眩暈頭痛,心悸失眠,胸悶氣短等[1-3]。方中天麻含有天麻素、腺苷、5-羥甲基糠醛、巴利森苷A等成分,具有腦保護、抗暈眩、鎮靜催眠等作用[4-7];丹參中含丹酚酸B、5-羥甲基糠醛、迷迭香酸等成分,有抗凝血、改善微循環等作用[8,9];溫郁金具有抗血栓、抗炎等活性[10];何首烏含有二苯乙烯苷類、腺苷、沒食子酸等成分,具有明顯的抗衰老及神經保護、降血脂及抗動脈粥樣硬化等作用[11-14];川芎含有腺苷、阿魏酸等成分有治療心血管疾病、中樞神經系統作用[15,16];山楂含有沒食子酸,具有明顯的抗氧化作用[17-19]。本制劑制備工藝主要為水提與生藥粉碎等[1]。該制劑在本院及研究報道中對眩暈頭痛等患者臨床療效較好[20]。因此,分析本制劑的物質基礎很有必要。本文參照中藥特征圖譜的有關技術要求[21]及運用高效液相色譜(HPLC)法對本制劑進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀,型號Prominence UFLC,SPD-M20A二極管陣列檢測器,LC/Labsoluion色譜工作站,日本島津公司;KQ-5200DE臺式數控超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;十萬分之一電子分析天平,型號MS105DU,梅特勒公司;色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),瑞典阿克蘇諾貝爾(Akzo Nobel)公司;乙腈、甲醇,色譜級,美國Fisher公司;水為自制超純水;其余為分析純。腺苷(批號:HA069554,含量98.0%)、二苯乙烯苷(批號:HO118401,含量98.0%)、沒食子酸(批號:HA175312,含量98.0%)、丹酚酸B(批號:HS034208,質量分數98.0%)、巴利森苷A(批號:BP1063,含量95.0%)等對照品均購自寶雞辰光生物科技有限公司;天麻素(批號:110807-202010,質量分數95.5%)、5-羥甲基糠醛(批號:111626-202013,質量分數99.5%)、迷迭香酸(批號:111871-202007,質量分數98.1%)等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;川芎、制首烏、丹參、郁金、山楂、天麻等中藥材,均購自漢中市老百姓大藥房旗艦店;益腦心顆粒(國藥準字Z20025079,規格15g×9袋/盒,批號010001、010002、010003、010004、010005、010006、010007、010008、010009、010010),陜西漢王藥業股份有限公司生產。

1.2 特征圖譜測定方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液 (B),梯度洗脫,見表1。記錄時間為100 min。流速:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:270 nm;進樣量:10 μl。

表1 流動相梯度洗脫

1.2.2 混合對照與供試品溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品腺苷5.10 mg、天麻素5.24 mg、沒食子酸5.10 mg、5-羥甲基糠醛5.03 mg、二苯乙烯苷5.10 mg、巴利森苷A 5.26 mg、迷迭香酸5.10 mg、丹酚酸B 5.10 mg置于50.00 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液,各成分質量濃度均為0.10 mg/ml。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品3袋內容物,研細,混勻,取15.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇50 ml,稱定質量,超聲處理(功率100 W,頻率100 Hz) 30 min,取出,放冷,再稱定質量,用50%的乙醇補足其減失的質量,搖勻,以0.22 μm的微孔濾膜過濾,取續濾液得到供試品溶液。

1.2.3 精密度試驗 取供試品溶液(批號010001),連續進樣5次,分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行分析考察。計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積RSD值。

1.2.4 穩定性試驗 取供試品溶液(批號010001),分別于各時間點即0,2,4,8,12,24 h進樣,考察共有峰的相對保留時間和相對峰面積。計算各共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值。

1.2.5 重復性試驗 取6份供試品(批號010001),按供試品溶液的制備與色譜條件進行分析,分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行分析考察。計算各共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值。

1.2.6 特征圖譜建立及相似度分析 取10批益腦心顆粒樣品,分別按供試品溶液的制備與色譜條件進行分析,進樣量10 μl,記錄色譜圖,建立特征圖譜。計算10批樣品共有色譜峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值。參考文獻[21]對10批益腦心顆粒的特征圖譜進行相似度分析,將色譜工作站數據導入中藥特征圖譜相似度計算軟件,通過計算得出樣品對照特征圖譜的共有模式,并以此共有模式為對照譜圖R,進行整體相似度評價。

1.3 特征峰定性鑒別

1.3.1 色譜條件 同1.2.1項。

1.3.2 混合對照品溶液的制備 同1.2.2.1項。

1.3.3 供試品溶液的制備 同1.2.2.2項。

1.3.4 川芎供試品溶液的制備 取川芎粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,加熱回流1 h,濾過,收集濾液,減壓濃縮后,加入50%乙醇50 ml,超聲處理(功率100 W,頻率100 Hz))30 min,取出,放冷,再用50%乙醇補足其減失的質量,搖勻,0.22 μm的微孔濾膜過濾,取續濾液得到供試品溶液。

1.3.5 天麻供試品溶液的制備 取天麻粉末1 g置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇50 ml,余同1.2.2.2項。

1.3.6 制首烏供試品溶液的制備 取制首烏粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,余同1.3.4項。

1.3.7 丹參供試品溶液的制備 取丹參粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,余同1.3.4項。

1.3.8 郁金供試品溶液的制備 取郁金粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,余同1.3.4項。

1.3.9 山楂供試品溶液的制備 取山楂粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,余同1.3.4項。

1.3.10 特征峰鑒別 分別取混合對照品、益腦心顆粒供試品以及川芎、制首烏、天麻、丹參、郁金、山楂藥材供試品按色譜條件1.2.1項進樣測定,對特征峰進行指認。

2 結果

2.1 精密度試驗

35個共有峰的相對保留時間與相對峰面積RSD值分別小于2.0%和5.0%(見表2,3)。表明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗相對保留時間測定結果

表3 精密度試驗相對峰面積測定結果

2.2 穩定性試驗

35個共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值分別小于2.0%和5.0%(見表4,5),表明供試品溶液在24 h內具有良好的穩定性。

表4 穩定性試驗相對保留時間測定結果

表5 穩定性試驗相對峰面積測定結果

2.3 重復性試驗

35個共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值分別小于1.0%和5.0%(見表6,7),表明該方法重復性良好。

表6 重復性試驗相對保留時間結果

表7 重復性試驗相對峰面積結果

2.4 特征圖譜建立及相似度分析

10批樣品共有色譜峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均分別小于1.0%和5.0%(見表8,9),以峰18為參比物(S),對選定35個共有色譜峰進行譜峰匹配,生成對照譜圖R(見圖1,2),整體相似度結果相似度在0.900-0.998之間(見表10)。

1-35.特征指紋峰;1.腺苷;3.天麻素;5.沒食子酸;6.5-羥甲基糠醛;17.巴利森苷A;18.二苯乙烯苷(作為參照物的色譜峰);22.迷迭香酸;24.丹酚酸B圖1 益腦心顆粒HPLC對照特征圖譜Figure 1 HPLC reference characteristic chromatogram of Yinaoxin granules

表8 10批樣品相對保留時間結果

R. 10批擬合特征圖譜;S1-10.生產批號分別為010001,010002,010003,010004,010005,010006,010007,010008,010009,010010圖2 10批益腦心顆粒的HPLC特征圖譜Figure 2 HPLC characteristic chromatogram of 10 batches of Yinaoxin granules

表9 10批樣品相對峰面積結果

表10 10批制劑相似度測定結果

2.5 特征峰定性鑒別

特征峰1-35來自不同藥材,川芎中出現特征峰1,2,4,9-11,13-16,20,23,32-34;制首烏中出現特征峰1,4,5,10,11,14-16,18,19,25,27,31-33,35;天麻中出現特征峰1-4,6-12,14,16,17,20,25,32;丹參中出現特征峰6,8,11-13,15,20-31,33;郁金中出現特征峰9,10,20,29,30-33;山楂中出現特征峰5,8,11,13,14,16,32。指認出8個特征峰分別是:峰1為腺苷、峰3為天麻素、峰5為沒食子酸、峰6為5-羥甲基糠醛、峰17為巴利森苷A、峰18為二苯乙烯苷、峰22為迷迭香酸、峰24為丹酚酸B(見圖3)。

A.益腦心顆粒;B.制首烏;C.川芎;D.天麻;E.郁金;F.丹參;G.山楂;H.混合對照品;1.腺苷;3.天麻素;5.沒食子酸;6.5-羥甲基糠醛;17.巴利森苷A;18.二苯乙烯苷;22.迷迭香酸;24.丹酚酸B圖3 供試品、混合對照品及各藥材HPLC色譜圖Figure 3 HPLC chromatogram of test substance, mixed reference substance and medicinal materials

3 討論

特征圖譜測定實驗是使用二極管陣列檢測器對益腦心顆粒樣品進行全波長掃描,比較樣品分別在210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330 nm波長處時測定結果,比較不同波長下色譜峰信息,如色譜峰數量、各色譜峰的分離度等,結果在270 nm時較為理想,故作為該制劑特征圖譜的測定波長。主要活性成分鑒別實驗依據各成分出峰時間與紫外最大吸收值,參比物二苯乙烯苷最大吸收值分別在217 nm和311 nm處,定性鑒別的其他幾個成分的最大吸收值分別為腺苷(217,265 nm)、天麻素(220,269 nm)、沒食子酸(218,271 nm)、5-羥甲基糠醛(232,281 nm)、二苯乙烯苷(217,311 nm)、巴利森苷A(220,270 nm)、迷迭香酸(219,311 nm)、丹酚酸B(219,288,309 nm),在270 nm時均能良好地顯示色譜峰且分度符合要求。因此,綜合考察后確定益腦心顆粒特征圖譜檢測波長為270 nm。

本制劑為中藥復方,成分復雜,極性不一,所以采用梯度洗脫方法。曾選擇不同品牌的反相C18色譜柱(如安捷倫XDB-C18、ZORBAX Eclipse Plus C18、Ultimate?XB C18、Intersil C18、Kromasil C18),不同規格(如250 mm×4.6 mm, 5 μm 、150 mm×4.6 mm, 5 μm)進行過比較;選擇不同流動相系統[如甲醇-水、乙腈-磷酸水溶液(0.1%,0.2%,0.5%,1.0%)、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液(0.2%,0.5%,1.0%)等],不同柱溫(25,30,35,40 ℃)、不同流速(0.5,0.8,1.0,1.2 ml/min)等;最終結果采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)與流動相系統乙腈-0.1%磷酸水溶液、柱溫為30 ℃、流速為1.0 ml/min,在此條件下各特征峰分離度較好、經過方法考察具有良好的重復性與穩定性,故將此條件作為本方法的色譜條件。

制備供試品溶液方法的選擇,本制劑中天麻為生藥粉入藥,其余藥味均為水提取。比較了不同溶劑(乙醇、甲醇、水)及溶劑不同濃度(即0,50%,100%)、不同處理方法(加熱回流,超聲及其不同處理時間15,30,45,60 min)等,結果加熱回流與超聲提取比較,超聲提取時間短且色譜峰信息豐富;而選用50%乙醇作為溶劑優于50%甲醇。因此,選擇50%乙醇超聲處理30 min作為本方法供試品溶液的制備方法。

在特征峰鑒別實驗中,特征峰個數依次為丹參中19個>天麻中17個>制首烏中16個>川芎中15個>郁金中8個>山楂中7個。在35個特征峰中,指認出8個特征峰即腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、巴利森苷A、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B,為繼續研究該制劑的藥代動力學奠定了基礎。本文引言已論述,它們均具有不同的藥理活性,是制劑的功效成分之一。

綜上所述,經上述研究建立了益腦心顆粒的HPLC特征圖譜測定方法,該方法穩定性、精密度、重復性良好,操作簡單、易于實施,能夠較為整體全面地反映益腦心顆粒的化學成分信息,因此該方法為益腦心顆粒質量的評價提供了參考,為制劑臨床研究提供了依據。