褪黑素上調SIRT1改善高糖誘導原代心肌細胞損傷的機制研究

艾永飛,劉 靜,蘇菲菲,楊競霄,尚福軍

(空軍軍醫大學第二附屬醫院心血管內科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:434979751@qq.com)

糖尿病是嚴重威脅人類健康的重要疾病之一,2019年國際糖尿病聯盟(IDF)(http://www.diabetesatlas.org/)最新數據顯示,2019年全球約有4.63億糖尿病患者,預計到2045年全球將有7億糖尿病患者。由于糖尿病是心血管疾病的重要危險因素之一[1],糖尿病引起的心血管疾病發病率和死亡率的增加已經成為全球健康防治領域的重要難題。糖尿病所造成的心臟結構和功能的改變主要表現為心肌肥厚、心肌舒張功能不全、心肌間質纖維化和心肌細胞凋亡[1],但其具體發生機制尚不明確,并缺少有效的防治措施。研究表明,高血糖能夠直接引起心肌細胞損傷和凋亡[2],而心肌細胞作為終末端分化細胞,其再生與增殖極弱,因此心肌細胞的損傷與凋亡被認為是高血糖引發心血管疾病發生發展的關鍵原因。

褪黑素是由哺乳動物松果體分泌在全身多個臟器均發揮調節作用的一種胺類激素,其分泌具有晝夜節律性,夜間合成較多,白天分泌較少[3]。研究顯示,褪黑素在心血管領域具有減輕心肌缺血損傷和心肌肥厚,防治心衰等疾病的作用。最新研究也顯示:褪黑素能夠改善睡眠,治療2型糖尿病[3,4]。然而,褪黑素在糖尿病心肌病中的生物學作用及其機制尚未明確,本研究擬從細胞水平探討褪黑素在高糖誘導的原代心肌細胞損傷的作用以及機制,為糖尿病心肌病的治療提供新的實驗依據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

C57BL/6乳鼠,出生1-3 d,購自第四軍醫大學實驗動物中心;褪黑素、膠原酶Ⅱ購自美國Sigma公司、沉默信息調節因子2相關酶1(sirtuin1,SIRT1)、Beclin1和自噬相關5同源物(autophagy related 5 homolog,Atg5)購自美國CST公司;cleaved Caspase-3、Bcl-2-associated X的蛋白質(Bcl-2-associated X,Bax)和B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)購于美國Abcam公司;GAPDH購自美國Santa Cruz公司,TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA強裂解液及5×loadding buffer購自上海碧云天生物有限公司;PVDF膜及ECL發光液購于美國Millipore公司;EX527購自美國Selleck Chemicals公司;First Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ購自日本Takara公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司;高糖DMEM、低糖DMEM培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代心肌細胞培養與實驗分組 取新生3 d內的C57BL/6小鼠,3%異氟烷深度麻醉后,脫頸處死。750 ml/L乙醇消毒,打開胸腔,摘取心臟,去心房,并用預冷的DPBS漂洗3次。將心室肌剪為<1 mm3的組織塊,靜置吸棄DPBS,加入5 ml的0.5 mg/ml的膠原酶Ⅱ,37 ℃振搖消化20 min;加入含有10% FBS的培養基終止消化,吸取上層混懸液,下層組織再次加入消化液進行消化,直至組織塊完全消化。將收集的上層混懸液經200目濾網過濾,收集濾液至離心管,800 r/min離心5 min,收集細胞,然后加入含有10%FBS的培養基,按照5×105個/皿的細胞密度進行接種,然后在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h。為了檢測高糖對心肌細胞的損傷,我們將原代心肌細胞分別用5.5,11,22,33 mmol/L D-葡萄糖刺激處理時間為24 h。

為了闡明褪黑素上調SIRT1改善高糖誘導的原代心肌細胞損傷的作用機制,我們將原代心肌細胞分為對照組(Con組)、褪黑素對照組(Con+Mel組)、高糖對照組(HG組)、高糖+褪黑素組(HG+Mel組)、SIRT1抑制劑組(HG+Mel+EX527組)。Con組為5.5 mmol/L D-葡萄糖處理24 h;褪黑素對照組(Con+Mel組):在添加5.5 mmol/L D-葡萄糖培養基同時添加褪黑素,使其終濃度為100 μmol/L;高糖對照組(HG組):33 mmol/L D-葡萄糖;高糖+褪黑素組(HG+Mel組):在添加33 mmol/L葡萄糖培養基同時添加褪黑素,使褪黑素終濃度為100 μmol/L,處理24 h。SIRT1抑制劑組(HG+Mel+EX527組):在添加33 mmol/L葡萄糖培養基同時添加褪黑素和EX527,使褪黑素終濃度為100 μmol/L,EX527終濃度為10 μmol/L,處理24 h。

1.2.2 CCK-8檢測原代心肌細胞活力 按照每孔接種約4×103個細胞將原代乳鼠心肌細胞接種于96孔培養皿中,然后按照方法1.2.1中分組進行干預處理24 h,干預結束后棄掉培養基,PBS洗滌,然后加入200 μl高糖DMEM培養基(無血清)和20 μl CCK-8溶液于96孔板中,在37 ℃,50 ml/L CO2培養箱中培養40 min,然后使用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度值。

1.2.3 SOD和MDA檢測 細胞內氧化應激水平通過細胞內MDA和SOD含量進行評價,具體實驗方法參照MDA和SOD試劑盒說明書進行,MDA于532 nm處測定吸光度值,SOD于波長450 nm處測定吸光度值。

1.2.4 實時定量RT-PCR檢測SIRT1基因表達 提取細胞總RNA,按照反轉錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)說明書步驟,以20 μl體系進行反轉錄RCR,合成cDNA。引物序列見表1。之后參照定量檢測試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ)進行反應,使用GAPDH作為內參,用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.5 免疫印跡(Western blot)檢測SIRT、Beclin1、Atg5、Bax和Bcl-2表達 按照方法1.2.1中分組在各組細胞干預處理結束后,將其置于冰上,PBS漂洗多次,強RIPA裂解液(100 μl/106細胞)裂解20 min,細胞刮輕輕將刮取細胞轉移到離心管中,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,收集上清。上清液取出10 μl進行BCA蛋白定量,具體方法參照CA蛋白定量試劑盒說明書。剩余上清液加入1/4體積的5×loading buffer,沸水浴10 min,然后放置室溫5 min,之后將其放入-80 ℃保存。SDS-PEGE配置電泳用于蛋白的分離,上樣量50 μg/孔道,120 V,90 min電泳。300 mA,180 min轉膜,脫脂奶粉(50 g/L)室溫封閉2 h,然后在4℃下進行一抗(SIRT、Beclin1、Atg5、Bax和Bcl-2稀釋比1 ∶1 000)孵育,過夜。然后TBST漂洗,加入二抗(1 ∶6 000),室溫孵育2 h,TBST漂洗,進行ECL發光。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 按照方法1.2.1中分組原代心肌細胞干預處理24 h后,棄掉原細胞培養基,PBS多次漂洗,20 μg/μl的蛋白酶K室溫孵育20 min,然后進行TUNEL染色,倒置熒光顯微鏡采集圖像,Image plus軟件進行圖像分析。其中染色具體步驟參照據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 褪黑素對高糖所致原代心肌細胞活力下降和細胞損傷起到保護作用

CCK-8細胞活力檢測結果顯示:22,33 mmol/L D-葡萄糖刺激24 h后均造成原代乳鼠心肌細胞活力減低,且隨D-葡萄糖濃度的增加,細胞相對活性下降程度遞增(見圖1)。與5.5 mmol/L D-葡萄糖相比,33 mmol/L D-葡萄糖造成細胞相對活性降低30%以上,差異有統計學意義(P<0.05),因此在后續我們選擇33 mmol/L D-葡萄糖為高糖組模型建立的實驗濃度。給予褪黑素干預后,HG+Mel組原代心肌細胞活力較HG組上升(P<0.05),但Con+Mel組細胞活力與Con組相比無顯著性差異(P>0.05,見圖1)。

與5.5mmol/L D-葡萄糖相比,*P<0.05;與11 mmol/L D-葡萄糖組相比,△P<0.05;與22 mmol/L D-葡萄糖組相比,&P<0.05;與Con組相比,▲P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖1 褪黑素對高糖誘導的原代心肌細胞活力的影響 (n=6)Figure 1 Effects of melatonin on cell viability of primary cardiomyocytes exposed to HG (n=6)

2.2 褪黑素減輕高糖引起的原代心肌細胞氧化應激和凋亡

與Con組相比,HG組原代心肌細胞MDA水平增加(P<0.05),而抗氧化物SOD活性下降(P<0.05)。給予褪黑素干預后,與HG組相比,HG+Mel組MDA水平降低,SOD活性增加(P<0.05);但與Con組相比,Con+Mel組MDA水平和SOD無差異(見圖2)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖2 褪黑素對高糖引起的原代心肌細胞氧化應激的影響 (n=6)Figure 2 Effect of melatonin on oxidative stress of primary cardiomyocytes induced by high glucose (n=6)

2.3 褪黑素減輕高糖引起的原代心肌細胞凋亡

蛋白免疫跡實驗顯示:相比于Con組,HG組心肌細胞凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax升高,抗凋亡蛋白Bcl-2下降(均P<0.05)。但相比于HG組,HG+Mel組凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax的表達量降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表達量上升(均P<0.05);同時結果也顯示:相比于Con組,Con+Mel組cleaved Caspase-3和Bax表達無顯著差異,但Bcl-2表達量增加(見圖3)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖3 Western blotting檢測褪黑素對高糖引起的原代心肌細胞凋亡蛋白的影響 (n=6)Figure 3 Effect of melatonin on apoptosis-related proteins in high glucose-induced primary cardiomyocytes by Western blotting (n=6)

2.4 褪黑素對高糖導致的原代心肌細胞自噬活動抑制的影響

蛋白免疫印跡實驗結果顯示:HG組原代心肌細胞自噬相關蛋白Beclin1,Atg5表達較Con組降低(P<0.05)。褪黑素干預后,HG+Mel組Beclin1、Atg5表達量高于HG組(P<0.05)。而且,值得注意的是Con+Mel組Beclin1,Atg5表達量也較Con組增加(P<0.05,見圖4)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖4 Western blotting檢測褪黑素對高糖引起的心肌細胞自噬相關蛋白表達的影響 (n=6)Figure 4 Effect of melatonin on the autophagy-related protein expression in primary cardiomyocytes under HG conditions by Western blotting (n=6)

2.5 褪黑素在轉錄和翻譯水平提高新生乳鼠心肌細胞中SIRT1表達

實時定量RT-PCR結果顯示:相比于Con組,HG組心肌細胞SIRT1 mRNA水平下調(P<0.05);給以褪黑素處理后,Con+Mel組SIRT1表達相比于Con組增加,HG+Mel組SIRT1表達也相比于HG組增加(P<0.05)。SIRT1蛋白水平表達顯示出同基因水平相似的結果,相比于Con組,HG組SIRT1蛋白表達降低。給予褪黑素處理后,Con+Mel組SIRT1蛋白表達相比于Con組上升。HG+Mel組SIRT1蛋白表達相比于HG組增加(P<0.05,見圖5)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖5 實時定量RT-PCR和Western blot檢測褪黑素對原代心肌細胞SIRT1表達的影響 (n=6)Figure 5 Effect of melatonin on Sirt1 mRNA and protein expression in primary cardiomyocytes by RT-PCR and Western blot (n=6)

2.6 褪黑素對心肌細胞自噬的影響與SIRT1有關

本實驗通過添加SIRT1的特異性小分子抑制劑EX527干預SIRT1,來研究褪黑素與SIRT1關系。與前面結果一致,與Con組相比,HG組自噬相關蛋白Beclin1和Atg5表達降低(P<0.05)。但褪黑素干預后,HG+Mel組Beclin1和Atg5表達較HG組增加(P<0.05)。添加EX527特異性抑制SIRT1活性后,HG+Mel+EX527組Beclin1、Atg5表達量相比于HG+Mel組減少(P<0.05,見圖6)。

與HG組相比,#P<0.05;與HG+Mel組相比,*P<0.05圖6 褪黑素通過SIRT1上調原代心肌細胞自噬 (n=5)Figure 6 Melatonin increased autophagic activities in primary cardiomyocytes under HG conditions by SIRT1 pathway (n=5)

2.7 褪黑素通過SIRT1途徑減輕高糖引起的原代心肌細胞凋亡

蛋白免疫印跡結果顯示:相對于HG+Mel組,添加EX527特異性抑制SIRT1活性后,HG+Mel+EX527組cleaved Caspase-3和Bax表達量增高(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降(P<0.05,見圖7)。

與HG組相比,#P<0.05;與HG+Mel組相比,*P<0.05圖7 蛋白免疫印跡檢測心肌細胞凋亡 (n=5)Figure 7 Apoptosis level in primary cardiomyocytes detected by western blot (n=5)

除此之外,我們通過TUNEL染色檢測細胞的凋亡比率,結果顯示,HG組原代心肌細胞凋亡比例高于Con組(P<0.05);給予褪黑素預處理后,HG+Mel組原代心肌細胞凋亡比例低于HG組(P<0.05);Con+Mel組原代心肌細胞凋亡與Con組相比無差異(P>0.05);添加EX527特異性抑制SIRT1活性后,HG+Mel+EX527組原代心肌細胞凋亡比例高于HG+Mel組(P<0.05,見圖8)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05;與HG+Mel組相比,△P<0.05圖8 TUNEL染色檢測原代心肌細胞凋亡 (×20)Figure 8 The apoptosis level in primary cardiomyocytes by TUNEL staining (×20)

3 討論

糖尿病是排除年齡、高血壓、肥胖和冠心病后的心血管疾病的獨立危險因素,它能夠造成心臟結構上的改變,如心肌肥大、纖維化、細胞壞死和凋亡等,進而導致心臟功能減退,最終導致心力衰竭[5]。盡管目前對于糖尿病引發的心血管疾病發生的機制尚不明確,但是高糖直接誘導的心肌細胞的損傷和凋亡被認為是糖尿病引發心血管疾病發生病理改變的關鍵因素。因此,深入研究高糖誘導的心肌細胞損傷和凋亡的發生機制及其防治措施對糖尿病心血管疾病的防治具有重要意義。

研究表明,高糖導致的心肌細胞凋亡增多可能與氧化應激的失調密切有關[6]。在正常生理情況下,細胞內產生的活性氧可被SOD抗氧化物有效清除,但在病理條件下抗氧化物活性減低,活性氧難以被消除,活性氧在細胞累積過多,進而造成細胞內容物被氧化,細胞凋亡發生。本研究發現與文獻報道一致[7],高糖導致細胞內活性氧生成增多和清除能力的下降,細胞凋亡增加,具體表現:HG組較Con組心肌細胞MDA表達增高,SOD活性下降,心肌細胞凋亡比率上升、凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax表達上升,抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降(P<0.05)。褪黑素作為一種胺類激素,具有高度的親脂性,可以通過循環系統進入幾乎全身各個組織細胞發揮抗炎和抗氧化應激等作用[3,4]。但褪黑素是否能夠抑制高糖導致的心肌細胞凋亡,其機制如何,是否與抗氧化應激相關暫不清楚。我們的研究從細胞水平探討褪黑素在高糖誘導的原代心肌細胞損傷和凋亡的作用和相關機制。我們發現,添加褪黑素可抑制高糖引起的MDA生成,并增加抗氧化物SOD活性,抑制高糖引起原代心肌細胞凋亡,抑制cleaved Caspase-3和Bax表達上調,促進Bcl-2的表達。而且有趣的是,我們結果也顯示添加褪黑素不會引起正常對照組細胞氧化應激水平和凋亡水平的增加,但卻促進了正常對照組細胞抗氧化物SOD活性的提高,增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。以上結果提示:褪黑素可能通過調控細胞凋亡和氧化應激而發揮抗高糖毒性的心肌保護作用。

沉默信息調節因子2相關酶1(sirtuin1,SIRT1)是一種NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶,它通過對包括組蛋白和轉錄因子在內的多種蛋白去乙酰化,進而在調節細胞分化、衰老、凋亡、應激應答以及衰老等方面發揮重要作用[8]。SIRT1由催化區域和催化區域外的N端區域和C端區域兩個部分,共747個氨基酸組成。目前,研究發現SIRT1在包括大腦、心臟、肝臟、胰腺、骨骼肌、脾臟及脂肪組織等多個身體器官廣泛表達,參與轉錄調節、染色質修飾、能量代謝和炎癥反應等過程[9]。在心血管系統中,大量研究表明SIRT1活性增加可以抵御心肌細胞的損傷,發揮抗動脈粥樣硬化、抗心肌衰老、減輕心肌肥大與纖維化、改善缺血再灌注損傷等多種作用[10]。目前對于SIRT1作用機制盡管仍有爭議,但不容否認的是多數研究發現SIRT1是調控氧化應激和凋亡的關鍵信號分子[9-11]。此外,在心肌缺血模型中,褪黑素被證實能夠通過激活SIRT1改善心肌缺血損傷[12]。但是褪黑素是否通過SIRT抑制高糖介導的心肌損傷,以及機制如何,尚不明確。本研究發現,高糖組原代心肌細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達較對照組減低;而在存在或不存在高糖刺激的條件下,褪黑素均能增強SIRT1 mRNA和蛋白表達,降低氧化應激水平,抑制原代心肌細胞凋亡,部分對抗高糖引起的細胞損害。而為了進一步研究SIRT1在褪黑素對高糖誘導的原代心肌細胞損傷的保護作用,我們用EX527,一種SIRT1的特異性抑制劑,去阻斷SIRT1信號,發現褪黑素拮抗高糖誘導的原代心肌細胞凋亡的作用被EX527剝奪,提示褪黑素的原代心肌細胞保護作用依賴于SIRT1的上調。

自噬是吞噬自身受損、變性和錯誤折疊等的蛋白質和細胞器并使其包被進入囊泡,并通過與溶酶體形成自噬溶酶體,降解其內容物的生理過程。自噬是細胞保持細胞器新陳代謝穩態,進而進一步保持細胞活性穩定的必要過程.[13]。以往研究發現,心臟中自噬維持是心臟正常運作的必要條件,心臟條件性敲除自噬相關基因則會引起心臟功能障礙[14]。目前已有研究表明,SIRT1通路對衰老、凋亡、糖尿病心肌病、缺血再灌注損傷等的保護作用,可能均與細胞自噬的激活相關[15]。但褪黑素通過SIRT1激活抵抗高糖誘導的原代心肌細胞凋亡,是否與SIRT1對細胞自噬的調控相關,仍不清楚。我們結果發現,高糖刺激心肌細胞,自噬相關蛋白Beclin1,Atg5表達量降低;褪黑素干預則在存在和不存在高糖刺激的條件下,均能提高原代心肌細胞Beclin1、Atg5表達量。而給予SIRT1抑制劑EX527抑制SIRT1活性后,相比于HG+Mel組,HG+Mel+EX527組Beclin1和Atg5表達量減少,心肌細胞凋亡增加。以上提示褪黑素抑制高糖誘導的原代心肌細胞凋亡作用與SIRT1對自噬的調節有關。

綜上所述,本研究發現褪黑素抑制高糖誘導原代心肌細胞凋亡,其可能是通過激活SIRT1,增強細胞自噬,抑制氧化應激,進而減少細胞凋亡發揮其心肌保護作用。