OPN/CD44通路在缺氧誘導肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用及其機制

吳樹全,王生蘭

(1青海省第五人民醫院急診科,西寧 810000;2青海大學醫學院病理生理學教研室)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種彌漫性肺微血管重塑疾病,伴有肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)惡性增殖,導致持續的肺動脈壓升高,右心室肥大和死亡[1,2]。血管重塑是PAH的關鍵病理特征,其中PASMCs異常增殖是肺動脈血管重塑的主要機制,但目前針對肺血管重塑的療法在逆轉PAH方面效果仍不佳[3],因此,積極地探索調控PASMCs增殖的分子機制可能有助于改善PAH的臨床治療效果。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種多效性細胞因子,與細胞增殖密切相關[4]。另有研究證實,OPN可能參與特發性和低氧性肺動脈高壓的發病機制,其上調可能有助于PASMCs增殖,但其具體分子機制尚不清楚[5]。CD44是一種廣泛表達的選擇性剪接、翻譯后修飾的跨膜糖蛋白,在調節細胞存活、維持功能性血管屏障和血管生成中至關重要[6]。然而,OPN在低氧誘導下對人PASMCs(human PASMCs,HPASMCs)細胞增殖的影響及其作用機制是否與CD44相關未見報道。因此,本研究選擇體外培養HPASMCs細胞,模擬低氧環境,探討OPN/CD44通路對HPASMCs細胞增殖的影響,以期為臨床PAH治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要材料 HPASMCs(3110)購自上海中喬新舟生物科技有限公司;SMCM培養基(1101)購自北京裕恒豐科技有限公司;OPN-siRNA及OPN-siRNA陰性對照(negative control-siRNA,NC-siRNA)序列由吉瑪基因公司構建。DMEM培養基(11995)、PCR試劑盒(RP1100)、胰酶消化液(T1350)、Trizol試劑盒(R1100)、RIPA裂解液(R0020)、逆轉錄試劑盒(T2210-200T)、ECL發光液(PE0010)購自北京Solarbio公司;OPN、CD44及β-肌動蛋白(β-actin)引物序列由上海生工生物工程有限公司設計合成;增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)(13-3900)、Cyclin D1(33-3500)、Cyclin E(MA5-14336)、p27(MA5-12835)、OPN(MA5-17180)、CD44小鼠抗人單克隆抗體(MA5-13887)、山羊抗小鼠IgG(H+L)二級抗體(A32723)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要儀器 HF160W型CO2細胞培養箱購自上海Heal Force公司;cell+100型低氧細胞培養工作站購自廣州市華粵行儀器有限公司;T100型PCR儀、ELX-8081U型酶標儀和Gel DocTMXR+型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;CytoFLEX型流式細胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPASMCs細胞培養 采用SMCM完全培養基(89%SMCM培養基+10%胎牛血清+1%生長因子+100 U/ml雙抗),在37 ℃、5%CO2培養箱中培養HPASMCs細胞,待細胞傳至3-4代消化收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 低氧處理HPASMCs細胞 將1.2.1培養的HPASMCs細胞,用DMEM培養基同化12 h,然后更換為SMCM培養基(平滑肌細胞專用培養基,其氨基酸、維生素和生長因子等配比不同于DMEM),置于37 ℃、1% O2低氧培養箱中培養24 h,建立低氧誘導模型。

1.2.3 細胞分組及OPN-siRNA沉默實驗 收集1.2.1對數期生長的HPASMCs細胞,鋪于6孔板,隨機分為常氧組、低氧組、OPN-siRNA+低氧組和NC-siRNA+低氧組。常氧組按照1.2.1方法培養24 h,低氧組、OPN-siRNA+低氧組和NC-siRNA+低氧組根據1.2.2低氧培養方法,使用不含雙抗的培養基培養6 h后,按照脂質體轉染步驟分別進行不轉染、OPN-siRNA轉染和NC-siRNA轉染6 h,更換為SMCM培養基低氧培養24 h。收集以上各組細胞用于后續實驗。

1.2.4 RT-qPCR實驗檢測OPN和CD44 mRNA表達 使用Trizol試劑盒提取1.2.3各組細胞RNA,并測定RNA濃度,取2 μl RNA反轉錄為cDNA,進行PCR擴增,完全按照PCR試劑盒說明書配置反應體系,反應程序設置如下:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環。以β-actin為內參,采用2-ΔΔCt法計算OPN mRNA及CD44 mRNA相對表達量,引物序列見表1。

表1 OPN mRNA、CD44 mRNA及β-actin引物序列

1.2.5 CCK-8實驗檢測各組HPASMCs細胞活性 將1.2.1對數期生長的HPASMCs細胞,按照密度為4.5×104個/孔,接種于96孔板,參照1.2.3方法分組并處理后,棄去上清液,每孔加入10 μl CCK-8溶液,繼續培養3 h,充分混勻后酶標儀檢測450 nm處各孔吸光值(OD值),以上每組設置6個復孔,計算各組OD均值,計算細胞活性,細胞活性=(實驗孔OD值-調零孔OD值)/(對照孔OD值-調零孔OD值)。

1.2.6 凋亡實驗檢測各組HPASMCs細胞凋亡率 根據凋亡試劑盒說明步驟,收集1.2.3各組HPASMCs細胞,依次加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,室溫孵育20 min,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.7 周期實驗檢測各組HPASMCs細胞周期變化 根據細胞周期檢測試劑盒說明書步驟,收集1.2.3各組HPASMCs細胞,PBS清洗后,加入預冷的70%乙醇固定過夜,收集細胞加入RNA酶,室溫孵育30 min后,進行PI單染,避光反應30 min,流式細胞儀檢測細胞周期變化情況。

1.2.8 蛋白免疫印跡分析檢測OPN、CD44、PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和P27蛋白表達 使用RIPA裂解1.2.3各組HPASMCs細胞,提取總蛋白,采用BCA法檢測蛋白濃度。取等量蛋白樣品,經凝膠電泳分離后,轉膜、封閉,加入稀釋后的一抗OPN、CD44、PCNA、Cyclin D1、Cyclin E、P27和β-actin(1 ∶1 000)及二抗(1 ∶5 000),發光檢測,實驗重復3次以上,利用Image J分析各條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組HPASMCs細胞增殖變化情況

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細胞存活率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細胞存活率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

表2 各組HPASMCs細胞存活率變化

2.2 各組HPASMCs細胞凋亡變化情況

與常氧組HPASMCs細胞凋亡率相比,低氧組HPASMCs細胞凋亡率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細胞凋亡率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05,見表3、圖1)。

表3 各組HPASMCs細胞凋亡率比較

圖1 各組HPASMCs細胞凋亡變化Figure 1 Apoptosis of HPASMCs in each group

2.3 各組HPASMCs細胞周期變化情況

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細胞SubG1期、G0/G1期比例顯著降低(P<0.05),G2/M期比例顯著升高(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細胞SubG1期、G0/G1期比例顯著升高(P<0.05),G2/M期比例顯著降低(P<0.05,見圖2,表4)。

圖2 各組HPASMCs細胞周期變化Figure 2 Changes of cell cycle of HPASMCs in each group

表4 各組間HPASMCs細胞SubG1期、G0/G1期、S期和G2/M期細胞百分比比較

2.4 各組HPASMCs細胞PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和P27蛋白表達變化

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細胞PCNA、Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達均顯著升高(P<0.05),P27蛋白表達顯著降低(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細胞PCNA、Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05),P27蛋白表達顯著降低(P<0.05,見圖3,表5)。

圖3 各組HPASMCs細胞中PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和P27蛋白的表達Figure 3 Expression of PCNA, Cyclin D1, Cyclin E and P27 proteins in HPASMCs in each group

表5 各組間HPASMCs細胞中PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和P27蛋白表達比較

2.5 各組HPASMCs細胞OPN和CD44 mRNA表達情況

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細胞OPN和CD44 mRNA表達均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細胞OPN和CD44 mRNA相對水平均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見表6)。

表6 各組間HPASMCs細胞OPN和CD44 mRNA相對水平比較

2.6 各組HPASMCs細胞OPN和CD44蛋白表達變化

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細胞OPN和CD44蛋白表達均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細胞OPN和CD44蛋白表達均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖4,表7)。

圖4 各組HPASMCs細胞中OPN、CD44、β-actin蛋白的表達Figure 4 Expression of OPN, CD44, β-actin proteins in HPASMCs

表7 各組間HPASMCs細胞中OPN、CD44蛋白表達比較

3 討論

PAH發病機制復雜,具有較高的致殘率和病死率,嚴重影響患者的生活質量[7]。隨著對PAH病理機制的深入研究,臨床上出現的PAH靶向治療藥物改善了PAH的治療效果,但PAH預后仍較差[8]。PAH作為一種快速進展的疾病,不斷完善其分子機制,可能有益于改善PAH臨床治療。此外,在機體低氧刺激下,肺血管會發生過度收縮和結構重塑異常,從而增加肺循環阻力和肺動脈壓力,導致不可逆PAH發生[9]。研究顯示,體外低氧持續誘導培養HPASMCs細胞是體外模擬肺動脈高壓模型的經典模型,能夠引起HPASMCs細胞的惡性增殖[10,11],因此本實驗選擇該模型進行初步探索。

Zhu等[12]發現,缺氧不僅誘導HPASMCs異常增殖,而且抑制凋亡發生。本研究結果顯示,持續低氧誘導相較于常氧培養能夠增強HPASMCs細胞增殖活性、抑制凋亡發生,提示模型建立成功。另有研究顯示,抑制HPASMCs細胞增殖和DNA合成,阻斷細胞周期從G0/G1到S期進程,提高凋亡率可能有助于對PAH發揮保護作用[13]。進一步周期檢測發現,低氧組HPASMCs細胞SubG1期比例相較于常氧組顯著降低,這與凋亡結果一致,而G0/G1期比例顯著降低,G2/M期比例顯著升高,提示低氧誘導促進HPASMCs細胞中DNA分裂。增殖細胞核抗原是DNA代謝的細胞中心,能夠在DNA復制過程中采用環形結構促進DNA合成[14]。此外,周期相關蛋白Cyclin D1、Cyclin E參與調控細胞周期,而細胞周期蛋白依賴性激酶p27能夠抑制細胞進入S期,抑制增殖發生[15]。本研究發現,低氧誘導使HPASMCs細胞中PCNA、Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達顯著升高,P27蛋白表達顯著降低,進一步驗證低氧條件下HPASMCs細胞異常增殖可能與干預細胞周期、DNA合成異常增加有關,但具體機制尚待明確。

OPN是一種具有酸性特征且富含天冬氨酸的高度磷酸化的多功能糖磷酸蛋白,在心血管疾病、癌癥、糖尿病和腎結石疾病以及炎癥、生物礦化、細胞增殖和傷口愈合過程中具有重要功能[16,17]。在大鼠成骨細胞中,促進OPN mRNA和蛋白表達可能有利于增強成骨細胞增殖活性[18]。OPN表達于各種細胞中,可以通過抑制細胞凋亡調節細胞存活[19]。CD44是常見的細胞黏附分子,已被公認可作為癌癥干細胞標記物,并能夠與細胞外基質成分OPN結合在腫瘤發生發展中發揮作用[20]。本研究結果顯示,低氧狀態下HPASMCs細胞OPN和CD44 mRNA和蛋白表達相較于常氧組顯著升高,提示低氧狀態下HPASMCs細胞活性增強可能與促進OPN和CD44表達相關。

近年來相關研究發現,OPN可通過整聯蛋白和CD44發出信號,在疾病或慢性炎癥中高度上調參與病理生理過程,并與新血管生成密切相關[21]。Cao等[22]研究發現,大鼠主動脈平滑肌細胞(rat aortic smooth muscle cells,RASMCs)增殖可能與OPN高表達相關,通過siRNA敲低OPN表達,能夠將RASMCs細胞周期阻滯在G0/G1期。本研究通過siRNA介導敲低OPN表達,結果顯示,與低氧組和NC-siRNA+低氧組HPASMCs細胞相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細胞OPN、CD44 mRNA和蛋白表達、存活率、G2/M期比例、PCNA、Cyclin D1、Cyclin E蛋白表達顯著降低,凋亡率、SubG1期、G0/G1期比例、P27蛋白表達顯著升高,提示敲低OPN表達水平,能夠抑制低氧誘導下HPASMCs細胞中CD44表達及細胞增殖,抑制周期相關蛋白表達,將細胞周期阻滯在G0/G1期,促進細胞凋亡,表明抑制OPN表達,能夠抑制低氧誘導下HPASMCs細胞中CD44表達,逆轉低氧誘導的細胞異常增殖,推測OPN可能是PAH治療的潛在分子靶標。

綜上所述,敲低OPN表達可能通過抑制CD44表達,將細胞周期阻滯在G0/G1期,抑制低氧誘導的HPASMCs細胞惡性增殖,促進其凋亡,這些發現可能為揭示PAH分子基礎及PAH臨床治療干預提供新思路。然而,PAH發病機制復雜,僅憑體外研究,證據尚不充分,還需要進一步聯合動物模型和臨床試驗進行更深入的探索。